(6 часов)

Различные свободноживущие простейшие - саркодовые, жгутиконосцы и инфузории - обитают нередко совместно. Поэтому наряду со специальными приемами работы с каждой группой ряд методов и технических указаний распространяется на всех простейших. Сбор простейших в природе непосредственно перед занятием не надежен. Раздаточный материал в нужном количестве и качественном составе обеспечивается только культивированием, т. е. созданием условий, благоприятных для жизни и размножения простейших.

Посуда. Для получения сборной культуры простейших пригодна разнообразная посуда из прозрачного не зеленоватого (бутылочного) стекла. Всякая металлическая посуда исключается из-за вредных влияний на животных металла, растворенного в воде, хотя бы даже в ничтожных дозах. Более пригодны банки с прямоугольным дном - аккумуляторные банки, прямоугольные стаканчики, но достаточно хороши и цилиндрические банки и стаканы и даже банки из-под консервов. Выборка материала облегчается при содержании его в плоских сосудах: кристаллизаторах (с отвесными стенками) и простоквашницах (с наклонными стенками); такие же сосуды небольшого объема - чашки Коха и чашки Петри.

Посуда требуется разной емкости: от 1/5-1/3 л до 3-4 л. Воду для культивирования простейших следует брать дождевую или талую; речную, озерную или прудовую воду необходимо предварительно кипятить и фильтровать через густое шелковое сито или бумажный складчатый фильтр. Водопроводная вода не пригодна, так как она хлорирована. Если все же приходится прибегать к водопроводной воде, ее следует предварительно дехлорировать. Для этого ее оставляют на несколько дней (от 7 до 10) в стеклянном сосуде и время от времени помешивают стеклянной палочкой; хлор постепенно улетучивается, а вода одновременно насыщается кислородом. Перед использованием воду профильтровать, как указано выше. Все же и после этого нельзя быть уверенным в полной пригодности такой воды для культивирования простейших. По мере испарения добавлять свежую воду, сохраняя, по возможности, один и тот же уровень.

Условия содержания банок с культурой. Развитие простейших во многом зависит от температуры воды и освещения. Наиболее благоприятна температура в пределах 18-23 °С; отрицательно сказывается не столько уровень ее, сколько резкая смена низкой и повышенной температуры. В дневном хорошем освещении нуждаются многие простейшие, для чего банки с культурой помещают вблизи окна, но защищают их каким-либо экраном (занавеска, ширма, картонная пластинка и т. п.) от неблагоприятного действия прямых лучей солнца в летнее время.

Устранить всякую возможность загрязнения воды каким-либо химическим веществом; в частности, пользоваться специально выделенными для аквариумов пипетками и не сливать обратно в банки пробы, взятые для просмотра. Сосуды с культурой не переносить с места на место, избегая тем самым встряхивания жидкости. Держать их закрытыми стеклянными пластинками; этим уменьшается испарение воды и загрязнение культуры пылью.

Питательная среда для простейших. Пищей простейшим чаще всего служат бактерии; поэтому для культивирования простейших готовят тем или иным способом питательную среду, богатую бактериями. Хорошие результаты достигаются настоем рисовых (или пшеничных) зерен, почвенным и навозным настоями. В колбе кипятить несколько минут зерна риса или пшеницы. Одновременно в другой колбе прокипятить воду, охладить ее при комнатной температуре, разлить в несколько чашек (например, Коха) и в каждую поместить по несколько подготовленных зерен.

Для изготовления почвенного настоя стеклянную банку наполнить на 1/4 огородной (садовой) почвенной землей " на 3/4 сырой водой. Навозный настой готовится из конского навоза, выдержанного в сухом прохладном месте (в подвале) в течение 10 дней; около 100г такого навоза постепенно залить одним литром кипятка при постоянном помешивании. Можно с успехом использовать смешанный настой: 100 г почвенной земли и 50 г навоза на 1 л воды. Приготовленную тем или иным путем питательную среду оставить на несколько дней (7-10) открытой с тем, чтобы в ней развилось возможно больше бактерий.

Заражение среды, простейшими. Несколько банок наполнить водой из разных небольших водоемов - пруд, лужа, придорожная канава - вместе с небольшим количеством ила и водной растительности - свежей и разлагающейся. Для устранения хищных животных (рачков, червей), губящих культуру, воду через несколько дней профильтровать, пользуясь сеткой из мельничного газа (средней плотности) или из капроновой ткани. Эту воду прилить в сосуды с приготовленной питательной средой (по 200-500 см³ в каждый).

Сборная культура простейших ставится не позднее как за месяц до использования ее на занятиях. Время от времени она просматривается, для чего пипеткой берут пробы из разных мест - со дна, из толщи воды, с поверхности пленки, с освещенной и затененной сторон; отмечают при этом, в какой банке и в каком месте наблюдается скопление простейших и каких именно.

САРКОДОВЫЕ

Амебы. Амебы встречаются в мелких пресноводных водоемах-прудах, канавах, лужах, болотах, - богатых гниющими растительными остатками преимущественно в придонном слое воды. В теплое время года их можно собрать для занятия непосредственно в природе. Тем или иным путем взмучивают поверхностный слой ила и собирают его вместе с водой в сосуд, экскурсионное ведерко. В частности, этого можно добиться, опустив в воду аквариумный сосуд или ведерко отверстием книзу; у самого дна водоема сосуд резко наклонить; выходящий воздух поднимет со дна, который вместе с водой наполнит банку. Амеб собирают также, осторожно соскабливая скальпелем поверхностный налет на нижней стороне плавающих листьев волной растительности. Использование материала возможно после того, как принесенная с водоема проба спокойно постоит несколько часов.

В более позднее время года амеб специально культивируют. В простейшем случае ограничиваются тем, что доставляют в лабораторию из подходящих водоемов воду вместе с илом и гниющими остатками; материал используют через 1/2 месяца. Культура становится обильнее, если ее подкормить; для этого доставленную из водоема воду после фильтрования приливают по полстакана в сосуд (банку, простоквашницу), в котором за 3-4 дня до этого нарезанное сено залито водой (слой воды над сеном около 2см).

Культура амеб, и в частности амебы протеус, развивается еще лучше на специально приготовленной питательной среде, исключающей к тому же присутствие рачков: на рисовом настое, почвенном настое. Лучшие результаты достигаются смесью почвенного настоя и настоя из молодых древесных веток. Одновременно с настоем на огородной почвенной земле готовится настой из молодых лиственных деревьев. Через 7-10 дней слить в один сосуд оба настоя в равных частях. Богатая микрофлора разовьется здесь через 5-7 дней. Питательную среду разлить в несколько небольших кристаллизаторов (чашки Коха) и заразить амебами, выловив их пипеткой из пробы, принесенной с водоема.

В любом случае культура сохраняется жизнеспособной 2-3 месяца, после чего следует произвести пересев в свежую питательную среду.

Перед началом занятия, по крайней мере за четверть часа, животные рассаживаются на предметные стекла. Пробы берутся пипеткой из придонного слоя культуры и с поверхностной пленки. Из сборной культуры быстрее и с большим успехом корненожки вылавливаются следующим путем: на поверхность воды осторожно плашмя накладываются покровные стекла; они удерживаются на пленке поверхностного натяжения и на нижней их стороне собираются саркодовые; через несколько часов или на другой день перед занятием стекла снимают и, не переворачивая, переносят на предметные стекла снабдив их восковыми ножками.

Микропрепараты менее пригодны для проведения занятия и используются при отсутствии живого материала. Для изготовления микропрепаратов амебы фиксируются подогретой перед использованием до 50-60° жидкостью Шаудина. Приготовление фиксатора: 8-9 г кристаллической сулемы нагреть до кипения в 100 см³ дистиллированной воды, охладить в темноте (получится насыщенный раствор), декантировать, смешать с 96-градусным или абсолютным спиртом в отношении 2:1. Покровное стекло с амебами, снятое с поверхностной пленки в аквариуме и снабженное восковыми ножками, наложить на каплю фиксирующей жидкости на предметном стекле. Жидкость фиксирует и одновременно приклеивает амеб к стеклу. Через 3-5 мин амеб подвергают йодированию, т. е. отмыванию йодом фиксатора, содержащего-сулему: покровное стекло снимают и погружают в смесь 1-2 частей йодной тинктуры и 100 частей 70-градусного спирта; сулема и йод образуют легка растворимое в спирте соединение. Смесь сменяют несколько раз до прекращения обесцвечивания (потребное для этого время не превышает 5-10 мин). Амебы остаются при этом приклеенными к стеклу жидкостью Шаудина.

Для лучшего выявления ядра препарат окрасить гематоксилином по Делафильду: промыть его предварительно 70-градусным спиртом, а затем дистиллированной водой и перенести на сутки в водный раствор красителя" (одна часть красителя на 150-200 частей дистиллированной воды). Гематоксилин можно заменить квасцовым кармином. Промыть препарат в воде,провести быстро через спирт возрастающей крепости для обезвоживания, просветлить в ксилоле (гвоздичном масле) и быстро заключить в канадский бальзам.

Арцеллы и диффлюгии. В культурах амеб всегда встречаются в большем или меньшем количестве и пресноводные раковинные корненожки - арцеллы, диффлюгии и др. Сбор их в природе, культивирование в лаборатории, приготовление питательной среды и рассаживание на предметные стекла осуществляется так же, как указано для амеб. Богатые сборы раковинных корненожек дает выжимка (рукой) мха: выжатый мох прополоскать в отжатой жидкости и снова выжать его. Изготовление тотальных; микропрепаратов ведется так же, как описано для амеб; микропрепараты раковин готовятся более простым путем.

Изготовление микропрепарата раковин на глицерин-желатине. Раковины корненожек не нуждаются в фиксации, окраске, обезвоживании и просветлении; вместо канадского бальзама можно использовать смесь глицерина-желатины. Приготовление: 7 г кристаллической желатины размочить в течение 2-3 ч в 42 см³дистиллированной воды; добавить 50 г глицерина и 0,5-1 г кристаллической карболовой кислоты; смесь, помешивая, подогреть на водяной бане, профильтровать через стеклянную вату и охладить; смесь затвердевает в прозрачную желеобразную массу.

Покровное стекло, снятое с поверхностной пленки аквариума с приставшими к нему раковинами, перенести на сутки в глицерин. Кусочек приготовленной смеси поместить в центре предметного стекла и слегка подогреть (над пламенем спиртовки, на металлической пластинке, лежащей на электроплитке, или иным путем); смесь разжижается; накрыть ее покровным стеклом с раковинами корненожек и очень осторожно подогревать с тем, чтобы избежать бурных токов смеси, которые могут вынести объект за пределы покровного стекла. Смесь должна заполнить все пространство под покровным стеклом, не выступая за края его.

Раковина фораминифер. Эти корненожки собираются вместе с морским песком. Песок отмучивают для удаления ила; грубые примеси удаляются просеиванием через металлическое решето с ячеями до 2 мм в диаметре. Фиксировать 70-градусным спиртом. Раковинки выбирают препаровальными иглами под лупой. Микропрепараты готовят на канадском бальзаме с проведением из 96-градусного спирта через абсолютный спирт или, при его отсутствии, через карбол-ксилол: одна объемная часть карболовой кислоты и четыре части ксилола.

ЖГУТИКОНОСЦЫ

Свободноживущие зеленоокрашенные жгутиконосцы. Эвглены и другие подобные жгутиконосцы обитают в стоячей загрязненной воде, т. е. богатой органическими веществами - в прудах, болотах и в лужах поблизости от навозных куч, где они иногда появляются в таких огромных количествах, что окрашивают воду в зеленый цвет.

Эвглен нетрудно разводить на искусственно приготовленной питательной среде. Основу ее составляет минеральная смесь Кнопа, Бенеке или Успенского; смесь Кнопа: сернокислого магния MgSCX-0,25 г, азотнокислого кальция Ca(NO₃)₂-1,0 г, фосфорнокислого калия КН₂РО₄ - 0,25 г, хлористого калия КС1-0,12 г, следы хлористого железа FCl₃, дистиллированная вода - 1 л. К ней через каждые 1-2 дня добавляется несколько капель мясного бульона. Последний готовится кипячением мелко нарезанных кусочков нежирного мяса с последующей фильтрацией через вату так же, как описано для культивирования дафний.Длительное культивирование эвглен возможно и на почвенном настое  с добавлением или без добавления бульона.

Культуру эвглен, собранных в природе или разведенных в искусственных условиях, можно "обогатить", т. е. сконцентрировать эвглен в небольшом объеме воды. Для этого сосуд, куда переносят воду с находящимися в ней: эвгленами (стаканчик, пробирку, небольшую колбу), закрывают со всех сторон черной бумагой, в которой вырезают небольшое отверстие; сосуд помещают отверстием к источнику света. Вследствие положительного фототаксиса (т. е. движения к свету) эвглены скапливаются в течение суток в небольшом освещенном пространстве, откуда они вылавливаются пипеткой.

Микропрепараты жгутиконосцев (эвглен). А. Для обнаружения жгута к капле культуры на предметном стекле прибавить каплю 10-процентного раствора красителя - опаловый синий. Тотчас же сделать на том же стекле тонкий мазок: другое (чистое) предметное шлифованное стекло подвести к капле смеси (культуры и красителя) и, удерживая стекло в наклонном положении, передвигать его вдоль первого стекла; смесь распределится на предметном стекле тонким слоем. После подсыхания нанести на мазок каплю канадского бальзама или глицерин-желатины и накрыть покровным стеклом. Бесцветные жгутики видны на голубом фоне красителя. Б. Для обнаружения хроматофоров обесцветить эвглен, продержав их 1-2 дня в темноте; парамил при этом потребляется, а хроматофоры выступают отчетливее. Фиксировать 2-процентным формалином, обезводить глицерином: к капле воды с фиксированными эвгленами добавить каплю глицерина и отсосать ее (осторожно!); поверх положить комочек смеси глицерин-желатины, подогреть и; накрыть покровным стеклом.

ИНФУЗОРИИ

Культура туфельки хвостатой. Культура ставится за 2-3 недели до использования ее на занятии. Для нее готовится питательная среда по любому описанному ниже способу. 1. Сенной настой: мелко нарезанное луговое сено: залить водой (речной, прудовой), которая должна на 1-2 см выступать над сеном. 2. Сенной навар: 15-20 г мелко нарезанного лугового сена залить 1л воды, в колбе с ватной пробкой кипятить 15-20 мин, навар охладить и разлить в чашки или простоквашницы, разбавляя остуженной кипяченой водой. 3. Настой на зернах риса и пшеницы. 4. Навозный настой 5. Молочная питательная среда: чистые химические пробирки залить на 3/4 профильтрованной через бумажный фильтр речной или прудовой водой, прибавить в каждую по 2-3 капли снятого молока, заткнуть ватными пробками.

Приготовленную тем или иным путем питательную среду оставить на несколько дней открытой с тем, чтобы в ней развились бактерии, которыми питаются инфузории. Для заражения к ней прибавляют (около стакана) воды, взятой из придонного слоя с некоторым количеством ила из водоема (пруд, озерцо, лужа), богатого гниющими растительными остатками. Массовые скопления туфелек заметны по краям сосуда поблизости от поверхности воды. В пробирки с молочной средой пересаживают пипеткой по 10-12 туфелек и сохраняют месяцами; 1-2 раза в месяц добавляют по капле молока.

Инфузорий для занятия выбирают из мест их скопления. Для получения: большего количества особей в небольшом количестве воды можно их сконцентрировать одним из следующих способов: 1) культуру профильтровать через складчатый бумажный фильтр, ополоснуть и воронку опрокинуть в чашку Петри; 2) перелить часть культуры в длинную трубку (до 1/2 м), вертикально-закрепленную в штативе: в силу отрицательного геотропизма туфельки соберутся в поверхностном слое; 3) центрифугировать культуру в течение 5 мин. и пробу взять со дна центрифужной пробирки.

Изготовление микропрепаратов туфелек. Тотальные микропрепараты готовят простейшим, хотя и не столь надежным, способом из фиксированных" 3-4-процентным формалином туфелек. После фиксации их в небольшой пробирке осторожно отсосать фиксатор пипеткой ("проверить под лупой, чтобы не удалить инфузорий); обезводить глицерином: внести в пробирку немного смеси равных частей глицерина и воды, через несколько часов заменить (контроль под лупой!) эту смесь более концентрированной - две части глицерина и одна часть воды; через несколько часов сменить смесь на чистый глицерин, в котором сохранять материал не менее суток. Несколько инфузорий перенести в каплю разогретой смеси глицерин-желатины. Можно туфелек окрасить квасцовым кармином, который приливается на несколько минут к фиксированным инфузориям, слегка отмытым водой; до обезвоживания краситель отмывается водой.

Вольвокс

В летнее время вольвоксов собирают водным сачком из мельничного газа. Сохраняют их фиксированными в 4-5-процентном формалине.

Культивирование. Культуру вольвоксов можно получить на почвенном наваре: 3 кг сухой огородной земли кипятить в 2 л воды в эмалированной посуде; отстаивать в течение двух дней, декантировать. После фильтрации жидкость уварить в колбе из стекла "Дружная горка" до объема в 0,5 л и добавить немного хлористого железа FеСl₃ (две платиновые петли). Навар сохранять в эрленмейеровской колбе из того же стекла с пробкой из стерильной ваты. При использовании разбавлять в 40 раз дважды дистиллированной водой. В такую жидкость перенести несколько живых вольвоксов, сохранять на подоконнике.

Изготовление микропрепаратов. Простейший способ: к капле воды с отсаженными фиксированными вольвоксами прибавить немного порошка гуммиарабика (на кончике скальпеля), оставить препарат для высыхания (накрыть каким-нибудь колпаком), нанести на образовавшуюся пленку каплю канадского бальзама или глицерин-желатины, накрыть покровным стеклом.

Предпочтительнее готовить микропрепараты на гуммиарабиковой смеси: в каплю такой смеси на предметном стекле пересадить несколько фиксированных в формалине вольвоксов и накрыть покровным стеклом. Не требуется при этом ни обезвоживания, ни просветления объекта. Способ приготовления гуммиарзбиковой смеси: 1 часть сухого гуммиарабика растворить в 10 частях дистиллированной холодной (без подогревания) воды с добавлением 10 частей глицерина; использовать через несколько месяцев после приготовления.

На глицерин-желатине препараты готовят с предварительным обезвоживанием путем проведения через глицерин возрастающей концентрации.