-Органическая экстракция.

-Фенол или фенол/хлороформ (1:1)

-Осаждение белков; образование белой разграничительной плёнки между фазой органического растворителя и водной фазой.

Спиртовое осаждение ДНК.

-96-100 % этанол;

-Изопропанол;

-Очистка 70 % этанолом;

-Ресуспендирование в ТЕ-буфере.

-Осаждение ДНК из раствора возможно с помощью этанола;

-Центрифугирование преципитата;

-Удаление супернатанта.

Преимущества метода экстракции органическими растворителями:

-Получение ДНК хорошего качества и высокой концентрации;

-Подходит для разных объектов;

-Хорошо работает со старым, разложившимся материалом, костями;

-Выделенная ДНК очень стабильна и хорошо хранится в замороженном состоянии.

Недостатки метода:

-Высокая токсичность;

-Занимает много времени:

-Не всегда удаляет ингибиторы;

-Возможна контаминация (большая смена наконечников и пробирок);

-Трудно автоматизировать.

Экстракция с помощью селики

-К клеточному экстракту добавляется гуанидинтиоцианат;

-Денатурируются все компоненты, за исключением ДНК;

-Связывание ДНК с частицами силикой. Силика может вноситься прямо в образец; или образец пропускают через колонку с силикой;

-Отмывка от клеточных компонентов;

-ДНК элюируется в раствор.

Преимущества метода экстракции с помощью силики:

-быстрота выполнения,

-прост в исполнении;

-экономичный,

-исключает наличие ингибиторов;

-можно автоматизировать.

Недостатки метода:

-сложно выделять ДНК из объектов с малым

количеством биологического материала.

Экстракция с помощью ионообменной смолы Chelex 100.

Chelex ® 100:

-Хелотобразующая смола, которая имеет высокую аффинность к поливалентным ионам металлов.

-Связывание c ионами металла (магния).

-Удаление ионов магния из раствора препятствует действию нуклеаз.

-Предотвращение деградации ДНК.

Преимущества данного метода:

-Безопасность, простота и быстрота;

-Возможность автоматизация процесса;

-Дешевизна;

-Смена 1 пробирки (используется минимум расходных материалов); исключена контаминация;

-Удаляет ПЦР-ингибиторы,

-Можно использовать для всех типов объектов, кроме костей;

-Пригодность для любой лаборатории.

Недостатки метода:

-Получается очень грубая, неочищенная ДНК;

-Непостоянство степени эффективности экстракции (т.е. количество и качество ДНК варьирует от образца к образцу);

-Высокая вероятность ингибирования самими смолами, -потенциальная нестабильность ДНК и ее деградация со временем;

-Полученная ДНК одноцепочечная, нельзя использовать для ПДРФ-анализа.

- бумажные фильтры

В основе целлюлозный фильтр (ВатманBFC180), пропитан смесью сильных буферов, которые лизируют образцы и связывают нуклеиновые кислоты, а белки денатурируются. Нуклеиновые кислоты защищаются от действия нуклеаз и ультрафиолета. Уничтожается фермент ДНК-аза, разрушающая ДНК.

Преимущества данного метода:

-Безопасное обращение с образцами (карта инактивирует микробы, включая переносимые кровью патогены);

-Быстрое выделение высококачественного образца ДНК;

-Длительное хранение образцов при комнатной температуре (карта препятствует росту бактерий и других микроорганизмов);

-Пригодность для большинства образцов жидкого вида (кровь, слюна, сперма, свежий костный мозг);

-Возможность автоматизации (ДНК можно амплифицироватьнепосредственно с бумажного перфората).

Недостатки метода:

-Повышенная стоимость по сравнению с ручными методами;

-Пригодность только для образца жидкого типа;

-Количество ДНК, имеющееся на перфорате, невозможно подвергнуть количественному анализу или скорректировать;

-Может потребоваться изменение протокола амплификации с целью введения поправки на объем ДНК на бумажном перфорате.