Лекция №
Методы выделения ДНК/РНК. Пробоподготовка.
ДНК может быть выделена из любого образца:
Этап пробоподготовки:
Должны выполняться общие требования, предписанные для взятие биологического материала и его транспортировки. Соблюдение температурного режима.
Нужно помнить:
-Цельная кровь должна быть охлаждена, но не должна быть заморожена;
-Если ДНК из образцов ткани не может быть экстрагирована в ближайшее 48 часов, биологический образец должен быть заморожен до температуры от -20˚ до -80˚С, либо крио-заморозка;
-Повторение циклов замораживания-оттаивания не рекомендуется из-за возможности разрушения ДНК;
-Исключить вероятность контаминации собранного биологического материала;
-Пробирки с антикоагулянтами, такими как ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), необходимо перемешать, чтобы не допустить свертывания образца. НЕ ВСТРАХИВАТЬ !!!
Необходимое оборудование:
1.Микроцентрифуга (скорость вращения -не менее 9000 g).
2.Холодильник/морозильник ( + 2 —8°С/ -20°С).
3.Термостат.
4.Ламинарный шкаф или ПЦР-бокс.
5.Вортекс (прибор для встряхивания и перемешивания) .
6.Дозаторы с меняющимся объемом: 0,5-10 мкл, 5-40 мкл, 40-200 мкл, 200-1000 мклг 1000-5000 мкл и наконечники к ним.
7.Пластиковые пробирки с крышками объемом 1,5 мл типа.
8.Эппендорф.
9.Штативы для пробирок и микропробирок.
10.Емкости для отходов.
11.Камера для горизонтального электрофореза.
12.УФ-трансиллюминатор
Методы выделения ДНК:
1. Метод экстракции с помощью органических растворителей;
2. Метод экстракции с помощью селики (диоксид кремния);
3. Метод экстракции с помощью гель-фильтрации;
4. Метод экстракции с помощью магнитных частиц;
5. Метод экстракции на микроцентрифужных колонках;
6. Ионообменная смола (Chelex);
7. Метод экстракции на бумажных фильтрах.
Выбор методики выделения ДНК зависит от поставленной задачи, время анализа и степени очистки.
В связи с тем, что существует разнообразные методы выделения и очистки нуклеиновых кислот, выбор наиболее подходящей методики базируется на следующих критериях:
-Нуклеиновая кислота;
-Организм-источник нуклеиновых кислот;
-Первичный материал ( растительные ткани, листья. Семена, продукты переработки и прочее);
-Ожидаемые результаты ( выход; частота; время, требующееся для очистки, и прочее);
-Дальнейшее использование нуклеиновых кислот (ПЦР, клонирование, введение метки, блот-гибридизация, ПЦР в реальном времени (RT-PCR), синтез к-ДНК и прочее.
Основные этапы методов выделения ДНК
-Лизис клеток;
-Лизис ядра;
-Удаление из полученного материала ингибиторов, инактивации клеточных нуклеаз;
-Отделение искомых нуклеиновых кислот от клеточной массы;
-Очистка и концентрирование ДНК.
Обычная процедура лизиса включает:
-Механическое разрушение (например, измельчение с помощью пестика, применение ультразвука, гипотонический лизис);
-Химическая обработка (например, лизис с помощью детергентов, хаотропных агентов, или тиоловое восстановление);
-Ферментативное расщепление белков (например, с помощью протеиназы К).
-Химическую обработку (например, лизис с помощью детергентов, хаотропных агентов, или тиоловые восстановления);
Хаотропный агент- вещество, способствующее нарушению трёхмерной структуры макромолекул (ДНК,РНК, белки) и их денатурации.
Примеры, хаотропных агентов:
Мочевина 6-8 моль/л;
Тиомочевина 2 моль/л;
Гуанидинхлорид 6 моль/л;
Гуанидинтиоционат6 моль/л;
Перхлорат лития 4,5 моль,л.
Химические методы
-Обработка клеточной стенки: лизоцим, ЭДТА (связывает ионы магния)
-Обработка клеточной мембраны детергентом (SDS- удаляет липидные молекулы.
После лизиса клеток и инактивации нуклеаз клеточная масса может быть легко удалена с помощью фильтрации или осаждения.
Спиртовое осаждение ДНК.
-96-100 % этанол;
-Изопропанол;
-Очистка 70 % этанолом;
-Ресуспендирование в ТЕ-буфере.
-Осаждение ДНК из раствора возможно с помощью этанола;
-Центрифугирование преципитата;
-Удаление супернатанта.
Преимущества метода экстракции органическими растворителями:
-Получение ДНК хорошего качества и высокой концентрации;
-Подходит для разных объектов;
-Хорошо работает со старым, разложившимся материалом, костями;
-Выделенная ДНК очень стабильна и хорошо хранится в замороженном состоянии.
Недостатки метода:
-Высокая токсичность;
-Занимает много времени:
-Не всегда удаляет ингибиторы;
-Возможна контаминация (большая смена наконечников и пробирок);
-Трудно автоматизировать.
Экстракция с помощью селики
-К клеточному экстракту добавляется гуанидинтиоцианат;
-Денатурируются все компоненты, за исключением ДНК;
-Связывание ДНК с частицами силикой. Силика может вноситься прямо в образец; или образец пропускают через колонку с силикой;
-Отмывка от клеточных компонентов;
-ДНК элюируется в раствор.
Преимущества метода экстракции с помощью силики:
-быстрота выполнения,
-прост в исполнении;
-экономичный,
-исключает наличие ингибиторов;
-можно автоматизировать.
Недостатки метода:
-сложно выделять ДНК из объектов с малым
количеством биологического материала.
РНК
! Нужно помнить:
-РНК нестабильна,
-РНК-азы,
Основными источниками РНК-аз являются руки, бактерии и грибы ,
которые могут распространяться с пылью.
При работе с РНК должен быть отдельный бокс.
Правила соблюдения при работе с РНК !
-Работа в перчатках;
-Пробирки, наконечники, вода свободная от РНК-аз,
-Предварительная обработка материалов нагреванием ( 180 ℃)
-Обработка поверхностей (DEPC-водой, щелочью, перекисью водорода).
Обезвреживание
1.Обезвреживание биоматериалов и реагентов проводят для каждой стадии отдельно, помещая одноразовую пластиковую посуду (пробирки, наконечники) колбы-ловушки вакуумных отсосов на 20-24 часа в специальные контейнеры, содержащие дезинфицирующий 10% раствор извести или 5% раствор хлорамина Б.
2.Агрозу и электрофорезный буферный раствор помещают в отдельный контейнер, добавляют 1 объём 0,5 М раствора 〖𝐾𝑀𝑛𝑂〗_4 и затем 1 объём 2,5 М HCl. Аккуратно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 4-6 часов. Добавляют 1 объём 2,5 М NaOH, аккуратно перемешивают. Сбрасывают нейтральные реактивы в канализацию.
Лекция №
Методы выделения ДНК/РНК. Пробоподготовка.
ДНК может быть выделена из любого образца:
Этап пробоподготовки:
Должны выполняться общие требования, предписанные для взятие биологического материала и его транспортировки. Соблюдение температурного режима.
Нужно помнить:
-Цельная кровь должна быть охлаждена, но не должна быть заморожена;
-Если ДНК из образцов ткани не может быть экстрагирована в ближайшее 48 часов, биологический образец должен быть заморожен до температуры от -20˚ до -80˚С, либо крио-заморозка;
-Повторение циклов замораживания-оттаивания не рекомендуется из-за возможности разрушения ДНК;
-Исключить вероятность контаминации собранного биологического материала;
-Пробирки с антикоагулянтами, такими как ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), необходимо перемешать, чтобы не допустить свертывания образца. НЕ ВСТРАХИВАТЬ !!!
Необходимое оборудование:
1.Микроцентрифуга (скорость вращения -не менее 9000 g).
2.Холодильник/морозильник ( + 2 —8°С/ -20°С).
3.Термостат.
4.Ламинарный шкаф или ПЦР-бокс.
5.Вортекс (прибор для встряхивания и перемешивания) .
6.Дозаторы с меняющимся объемом: 0,5-10 мкл, 5-40 мкл, 40-200 мкл, 200-1000 мклг 1000-5000 мкл и наконечники к ним.
7.Пластиковые пробирки с крышками объемом 1,5 мл типа.
8.Эппендорф.
9.Штативы для пробирок и микропробирок.
10.Емкости для отходов.
11.Камера для горизонтального электрофореза.
12.УФ-трансиллюминатор
Методы выделения ДНК:
1. Метод экстракции с помощью органических растворителей;
2. Метод экстракции с помощью селики (диоксид кремния);
3. Метод экстракции с помощью гель-фильтрации;
4. Метод экстракции с помощью магнитных частиц;
5. Метод экстракции на микроцентрифужных колонках;
6. Ионообменная смола (Chelex);
7. Метод экстракции на бумажных фильтрах.
Выбор методики выделения ДНК зависит от поставленной задачи, время анализа и степени очистки.
В связи с тем, что существует разнообразные методы выделения и очистки нуклеиновых кислот, выбор наиболее подходящей методики базируется на следующих критериях:
-Нуклеиновая кислота;
-Организм-источник нуклеиновых кислот;
-Первичный материал ( растительные ткани, листья. Семена, продукты переработки и прочее);
-Ожидаемые результаты ( выход; частота; время, требующееся для очистки, и прочее);
-Дальнейшее использование нуклеиновых кислот (ПЦР, клонирование, введение метки, блот-гибридизация, ПЦР в реальном времени (RT-PCR), синтез к-ДНК и прочее.
Основные этапы методов выделения ДНК
-Лизис клеток;
-Лизис ядра;
-Удаление из полученного материала ингибиторов, инактивации клеточных нуклеаз;
-Отделение искомых нуклеиновых кислот от клеточной массы;
-Очистка и концентрирование ДНК.
Обычная процедура лизиса включает:
-Механическое разрушение (например, измельчение с помощью пестика, применение ультразвука, гипотонический лизис);
-Химическая обработка (например, лизис с помощью детергентов, хаотропных агентов, или тиоловое восстановление);
-Ферментативное расщепление белков (например, с помощью протеиназы К).
-Химическую обработку (например, лизис с помощью детергентов, хаотропных агентов, или тиоловые восстановления);
Хаотропный агент- вещество, способствующее нарушению трёхмерной структуры макромолекул (ДНК,РНК, белки) и их денатурации.
Примеры, хаотропных агентов:
Мочевина 6-8 моль/л;
Тиомочевина 2 моль/л;
Гуанидинхлорид 6 моль/л;
Гуанидинтиоционат6 моль/л;
Перхлорат лития 4,5 моль,л.
Химические методы
-Обработка клеточной стенки: лизоцим, ЭДТА (связывает ионы магния)
-Обработка клеточной мембраны детергентом (SDS- удаляет липидные молекулы.
После лизиса клеток и инактивации нуклеаз клеточная масса может быть легко удалена с помощью фильтрации или осаждения.
Дата: 2019-11-01, просмотров: 307.
