С разработкой техники нехирургического извлечения эмбрионов у коров появилась возможность многократно получать зародыши без операционного вмешательства или убоя животного. Однако эффективность данного метода извлечения эмбрионов сравнительно низка (3-4 эмбриона за одно извлечение). К этому следует добавить, что данный прием позволяет получать эмбрионы, поступившие в матку на стадии морулы и бластоцисты. Для генетической и клеточной инженерии необходимы зародыши на стадии зиготы (одноклеточных эмбрионов), которые можно извлечь из яйцеводов только операционным путем. Существующие способы гормонального контроля времени овуляции у домашних животных не обладают точностью, следовательно, имеются большие трудности в получении зигот, необходимых для микрохирургии, путем естественного оплодотворения. В этой связи разработка техники оплодотворения вне организма имеет огромное значение в решении научных задач и практических вопросов, направленных на повышение эффективности разведения животных. С освоением техники оплодотворения in vitro появилась возможность развивать исследования по клеточной и генетической инженерии на млекопитающих и особенно на домашних животных. Какие практические задачи могут быть решены с помощью техники оплодотворения вне организма животного? Во-первых, проблема получения необходимого количества эмбрионов для трансплантации остается еще нерешенной, хотя трансплантация эмбрионов в настоящее время проводится достаточно успешно. Самки-доноры непредсказуемы в системе трансплантации эмбрионов, что объясняется высокой вариабельностью количества овулирующих животных и числа овуляций. Во-вторых, данный метод позволил бы получить значительно больше эмбрионов для трансплантации от животных с высоким генетическим потенциалом. Можно было бы создавать банки генетического материала путем сбора яичников у высокоценных самок во время убоя, что способствовало бы значительному ускорению селекции животных. В-третьих, метод оплодотворения in vitro намного быстрее и требует для работы значительно меньше спермы, а также может быть использован для объективной оценки оплодотворяющей способности сперматозоидов и яйцеклеток. В-четвертых, метод помогает селекционерам в преодолении бесплодия вследствие нарушения функций яйцеводов и матки. Вызывание суперовуляции, по мнению ряда исследователей, служит причиной повышенной эмбриональной смертности из-за изменения концентрации и соотношения половых гормонов. И, наконец, рассматриваемая техника позволяет получить сколь угодно много однояйцевых двоен, повысить эффективность использования семени от высокоценных быков. 

Созревание яйцеклеток вне организма. Экстракорпоральному оплодотворению предшествует культивирование ооцитов in vitro, во время которого происходит их созревание до метафазы 2. Спонтанное возобновление мейоза ооцитов, выделенных из фолликулов кролика и культивируемых в питательной среде, было открыто в 1935 г. Пинкусом и Энзманом. Причем ооциты проходили последовательно все стадии созревания до метафазы 2, то есть до стадии оплодотворения без каких-либо гормональных воздействий. Позже это явление было установлено у яйцеклеток других видов животных. К моменту рождения телки ее яйцеклетки достигают уже диплотенной стадии профазы мейоза (специфического вида клеточного деления), типичной лишь для половых клеток. При этом образованные половые клетки содержат одинарный (гаплоидный) набор хромосом. В диплотенной стадии гомологичные хромосомы расходятся, между ними образуется продольная щель. На этой стадии мейоза дальнейшее созревание ооцитов приостанавливается до физиологической зрелости особи. Важную роль в подавлении мейоза играют клетки гранулезы и некоторые компоненты фолликулярной жидкости. После подъема уровня лютенизирующего гормона in vivo или извлечения ооцитов из фолликулов ингибирующее действие прекращается и мейоз возобновляется. При этом, как было отмечено выше, продолжается процесс созревания яйцеклетки до метафазы 2, т.е. ооциты дозревают до стадии, пригодной для оплодотворения. Однако следует отметить, что этот процесс не равнозначен созреванию, которое проходит ооцит in vivo до его овуляции. В условиях культивирования ооцитов «в пробирке» происходит лишь созревание ядра без участия цитоплазмы. Вследствие этого in vitro созревшие ооциты не способны к дальнейшему развитию после оплодотворения, так как в этом процессе большую роль играют цитоплазматические факторы, ответственные за формирование структуры белков. Motlik, Fulka (1976) показали, что в процессе нормального развития ооцита после оплодотворения играют важную роль вещества, выделяемые из зародышевого пузырька в цитоплазму. Thibault et al. (1976) установлено, что для обеспечения полного физиологического созревания ооцита необходимы стероидные гормоны. Moor, Trounson (1977) отмечают, что культивирование яйцеклеток овец в среде 199 с добавлением фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) и лютеинизирующего гормона (ЛГ) по сравнению со средой без гормонов обеспечивает достижение метафазы большим числом ооцитов. Аналогичные результаты были получены и на коровах Fukui et al. (1982) при использовании эстрадиола, прогестерона, лютеинизирующего и хорионического гормонов. Отмечено заметное влияние половых стероидных гормонов (эстрадиола, прогестерона, тестостерона) на эффектиность созревания яйцеклеток, тогда как влияние гонадотропинов (ФСГ, ЛГ) было незначительным.

Исследования Dielman et al. (1983) показали, что в процессе созревания ооцитов содержание половых стероидных гормонов в фолликулярной жидкости коров подвергается значительным изменениям. Так, в первые 6 часов после выброса ЛГ в фолликулярной жидкости отмечается высокая концентрация эстрадиола (гормона, вырабатываемого яичником, надпочечником, а также плацентой и семенниками), затем она резко снижается и к 20 часам уменьшается более чем в 10 раз по сравнению с исходной. Аналогичные изменения претерпевает и содержание тестостерона в фолликулярной жидкости. Более стабильный уровень в течение упомянутого периода отмечен у прогестерона. Содержание последнего резко повышалось непосредственно перед овуляцией. Эти данные доказывают необходимость создания нестатической концентрации половых гормонов в культуральной среде в процессе созревания яйцеклеток. 

Moor, Trounson (1977) для повышения полноценности развития ооцитов использовали метод культивирования их внутри интактных фолликулов. В их экспериментах после трансплантации осемененной овце культивируемых in vitro ооцитов в изолированных фолликулах развитие до бластоцисты происходило у 26-50% яйцеклеток. Пересадка бластоцист в 63% случаев завершалась рождением ягнят. Позже было установлено, что многие явления внутри фолликулярных клеток, включая биосинтез стероидов и синтез белков, регулируют гонадотропные гормоны. Поэтому последние должны быть обязательным компонентом среды при культивировании ооцитов с фолликулярными клетками. 

Staigmiller, Moor (1984) с целью выяснения роли фолликулярных клеток в созревании ооцит культивировали их вместе без кумулюса (клетки на поверхности блестящей оболочки яйцеклетки), ооциты с кумулюсом или ооциты с кумулюсом и фолликулярными клетками. Культивирование осуществляли в среде ТС 199 с 10% фетальной сывороткой плода и гонадотропинами (ЛГ, ФСГ и пролактин) и эстрадиолом. Ооциты культивировали при 37 С в течение 24 часов в СО2 - инкубаторе при медленном покачивании, а затем пересаживали в яйцевод овцы в охоте. Сперму вводили перед пересадкой яйцеклеток в оба рога маток. Через 10-12 дней эмбрионы извлекались из матки и классифицировались по категориям. Результаты показали, что культивируемые in vitro ооциты без кумулюса в дальнейшем не развивались. Добавление фолликулярных клеток в культуральную среду без кумулюса не улучшило способность яйцеклеток к развитию, так как 83% ооцитов остались на одноклеточной стадии. Ооциты с кумулюсом, но без фолликулярных клеток, в 87% случаев остались одноклеточными. Развитие до вылупившейся бластоцисты у 37% ооцитов отмечалось при добавлении фолликулярных клеток с кумулюсом. В другом опыте культивирование оплодотворенных ооцитов с кумулюсом и слоем подлежащих грануляционных клеток (клетки молодой незрелой соединительной ткани обеспечивают энергетический субстрат ооциту) обеспечило развитие 43% клеток до бластоцисты, а после пересадки их реципиентам эмбриональная выживаемость достигала 63%. Добавление фолликулярных клеток к данному комплексу не оказало существенного влияния на развитие клеток. Результаты исследований свидетельствуют о том, что для развития оплодотворенных ооцитов требуется определенное критическое количество фолликулярных клеток, в то время как их присутствие для проявления мейоза не обязательно. Соматические клетки, служат не только энергетическим субстратом для ооцитов, но и участвуют в переносе некоторых предшественников аминокислот, нуклеотидов и фосфолипидов в ооцит. Фолликулярные клетки генерируют инструктивные сигналы, которые влияют на ядро и прямой синтез определенных структурных белков. Эти сигналы очень важны для созревания ооцитов в первые 6-8 часов после инициации мейоза. Изменение сигналов ведет к нарушениям в онтогенезе эмбриона. Неслучайно метод культивирования изолированных фолликулов признан многими исследователями как наиболее современный способ, применяемый для подготовки ооцитов к оплодотворению в условиях in vitro. Этот метод дает возможность сохранить естественные связи между ооцитом и соматическими элементами фолликула. В данном случае фолликул выступает в роли биофабрики стероидных гормонов. Сущность метода заключается в следующем. Фолликулы выделяют из яичников во время убоя скота и доставляют их в лабораторию в среде ТС-199. Яичники промывают стерильным физиологическим раствором, содержащим антибиотики, а затем разрезают скальпелем в месте вхождения в него сосудов. Фолликулы хорошо заметны на поверхности разреза. С помощью пинцета фолликулы отделяют от соединительной ткани и культивируют в СО 2 – инкубаторе в упомянутой среде с добавлением 20% фетальной сыворотки плода и гормонов СЖК, ФСГ, ЛГ, эстрадиола и инсулина в течение 48 часов. В таких условиях примерно до 70% ооцитов созревают до стадии метафазы 2.

Оплодотворение in vitro. Оплодотворение ооцитов «в пробирке» в настоящее время достигнуто у более 20 видов животных. В 1968 г. появилось первое сообщение о нормальном потомстве, полученном от мышей, в 1974 г. – от крыс, а в 1981-1984 гг – от крупного рогатого скота, свиней и овец.

Оплодотворение ооцитов in vitro означает, что сложные физиологические процессы, протекающие в организме беременной самки, должны проходить в относительно простых и статических условиях. Важным этапом в разработке метода оплодотворения in vitro было открытие явления капацитации сперматозоидов Chang, Austin (1951). Ими установлено, что оплодотворение наступает только в том случае, если сперматозоиды предварительно в течение нескольких часов до овуляции находятся в яйцеводе самки. В это время они претерпевают определенные физиологические изменения и становятся способными к оплодотворению. Считают, что капацитация сперматозоидов представляет собой прежде всего изменения или удаление протеина и других макромолекулярных субстанций в плазматической мембране спермия. Через плазматическую мембрану вымываются протеолитические ферменты, необходимые для пенетрации зоны пеллюцида. Продолжительность капацитации сперматозоидов мыши и хомяка в матке и in vitro составляет 1-2 ч, крыс - 5-6 ч, тогда как кроликов в матке - около 6 ч, а in vitro - около 10 ч. Chang (1959) впервые получил потомство после пересадки яйцеклеток, оплодотворенных in vitro сперматозоидами, капацитированными в матке кролика. После отработки условий капацитации сперматозоидов в половом тракте самки проводились опыты по капацитации in vitro. Для этой цели вначале в среду добавляли яйцеводную и фолликулярную жидкости или сыворотку крови. Позже была достигнута капацитация и оплодотворение in vitro у мышей в среде, содержащей бычий сывороточный альбумин и приуват натрия без добавок биологических жидкостей. Основной средой для капацитации сперматозоидов и оплодотворения in vitro у мышей крыс и хомяков был раствор Кребса-Рингера, содержащий глюкозу, сывороточный альбумин, лактат и пируват натрия.

Oliphant, Brackett (1973) с помощью иммунологических методов показали, что процесс капацитации включает удаление или перестройку компонентов семенной плазмы, которые покрывают поверхность сперматозоидов. Эти же исследователи предложили метод капацитации сперматозоидов in vitro, который заключался в следующем. Сперматозоиды отмывали от семенной плазмы суспензированием в дефинитивной изотонической или гипертонической среде и центрифугировали. Надосадочную жидкость сливали, а осадок снова суспензировали в свежей среде. Затем их инкубировали в среде в течение 20 мин, после чего подвергали центрифугированию при комнатной температуре. В последующем сперматозоиды инкубировали в водяной бане при 38°С. Оплодотворение in vitro проводилось следующим образом. Ооциты с кумулюсными клетками собирали с поверхности яичника и помещали в маленькие чашки Петри, содержащие дефинитивную среду. Оплодотворение проводили путем добавления примерно 1 млн. сперматозоидов в чашку, содержащую свежеовулировавшие яйцеклетки, после чего гаметы инкубировались во влажной камере с 5% СО 2 в воздухе при 38°С. Исследователями были пересажены 176 двух- и четырех-клеточных эмбрионов. Из них 24 эмбриона, или 13,1%, имплантировались, но большинство из них рассосалось.

В дальнейших опытах была определена оптимальная концентрация сперматозоидов для оплодотворения in vitro ооцитов лабораторных животных. Установлено, что при оплодотворении in vitro головки сперматозоидов проникают через зону пеллюцида у хомяков за 3-7 мин. У мышей и крыс продолжительность проникновения капацитированных сперматозоидов через зону пеллюцида и превращения головки сперматозоида в мужской пронуклеус составляет примерно 2 ч, а дробление оплодотворенной яйцеклетки наступает через 30 ч.

Л.К.Эрнст и соавт. (1983) осуществили экстракорпоральное оплодотворение без предварительной обработки сперматозоидов. В этих опытах сперму быков дважды промывали в средах Бринстера или ТС 199. Авторы заключают, что главным в оплодотворении является полноценное созревание яйцеклеток. Процент дробящихся ооцитов был одинаковым, когда созревшие яйцеклетки осеменяли капацитированными и некапацитированными сперматозоидами. По мнению исследователей, капацитация сперматозоидов – естественный процесс, завершающийся при прохождении через клетки кумулюса у зоны пеллюцида яйцеклетки. Если яйцеклетка полноценна и окружена клетками кумулюса, то и капацитация сперматозоидов протекает нормально к моменту их контакта с зоной пеллюцида.

Достигнутые результаты на лабораторных животных позволили ученым в начале 70-х годов приступить к разработке метода оплодотворения in vitro у домашних животных. Необходимо отметить, что если большинство экспериментальных исследований выполнялось на ооцитах после созревания in vivo, то аналогичные опыты с с.-х. животными проводились в основном на яйцеклетках, предварительно культивируемых in vitro с целью их дозревания.

Sreenan (1970) и Trounson et al. (1977) не наблюдали проникновения сперматозоидов в яйцеклетки коров, пересаженные в яйцеводы кролика, куда введены сперматозоиды быка. Результат был положительным в случае использования в качестве инкубационной системы для ооцитов яйцеводов овцы. Iritani, Niwa (1977) оплодотворили ооциты коров in vitro сперматозоидами, выдержанными в течение 12-14 ч в яйцеводе эстрального кролика. Эти же исследователи проводили опыты по капацитации сперматозоидов быка в изолированном половом тракте эстральной коровы. Сперму помещали в изолированный половой тракт коровы (рог матки и яйцевод), предварительно отмыв ее раствором Кребса-Рингера. После введения сперматозоидов яичниковый конец яйцевода, маточно-трубное соединение и шеечный канал матки лигатировали и помещали половой тракт в физраствор на 3-4 ч при 37°С. Затем промывали яйцеводы и рога матки с целью извлечения сперматозоидов, и последние вносили в среду с культивируемыми яйцеклетками на 18-21 ч. При этом оплодотворение яйцеклеток с образованием двух пронуклеусов было достигнуто в случае использования сперматозоидов, капацитированных как в яйцеводе (7%), так и в роге матки (6%). Дальнейшее совершенствование описанной техники позволило Iritani в 1980 году достичь оплодотворения 22-26% ооцитов. Эти яйцеклетки дробились до 2-4-клеточной стадии в условиях in vitro и in vivo. В этих опытах было установлено, что для капацитации сперматозоидов быка в половом тракте коров или самок другого вида требуется от 4 до 6 ч.

Оплодотворение яйцеклеток коров спрематозоидами, капацитированными in vitro, было достигнуто в конце 70-х годов. Для этой цели Bracett et al. (1978) использовали физиологическую среду с высокой ионной силой. В этих опытах, в отличие от предыдущих экспериментов, в которых применялись ооциты после дозревания in vitro, яйцеклетки извлекались из предовуляторных фолликулов или из яйцеводов вскоре после овуляции. По данным исследователей, 14 из 25 яйцеклеток оплодотворились, а 10 из них достигли 2-клеточной стадии за 24 ч и 4 из 7 ооцитов - 4-клеточной стадии за 48 ч. Позже Iritani et al. (1984) доказали, что сперматозоиды могут быть капацитированы не только в среде с высокой ионной силой, но и в изотонической среде. Причем, авторы пришли к заключению, что капацитация возможна в период хранения сперматозоида при температуре 20°С.

Эффективность оплодотворения in vitro в значительной степени зависит от факторов, связанных с яйцеклетками (Brackett et al., 1982). Так, проникновение сперматозоидов, капацитированных в среде с высокой ионной силой, в ооциты регистрировалось у 40% яйцеклеток, созревших в предовуляторных фолликулах или яйцеводах (так называемые тубальные ооциты), тогда как среди ооцитов, дозревших in vitro, только у 10% отмечено оплодотворение. Позже эффективность этого опыта подтвердилась авторами при получении двойни. 2 из 5 хирургических пересадок завершились двойневыми стельностями. Однако эффективность оплодотворения была невысокой -11-14%. Эмбрионы в условиях культивирования in vitro развивались до 4-8-клеточной стадии, что не позволяло экспериментаторам осуществить нехирургическую трансплантацию (для нехирургической трансплантации и замораживания требуется эмбрионы довести до стадии компактизации). Однако даже если и будет разработана совершенная методика экстракорпорального оплодотворения тубальных ооцитов, огромный генетический материал ооцитов, содержащихся в фолликулах, останется не реализованным в воспроизводстве и селекции. Только разработка метода получения телят от экстракорпорального оплодотворения фолликулярных ооцитов (яйцеклеток, созревших in vitro) создаст реальную возможность существенного повышения эффективности трансплантации и создания крупных банков эмбрионов от генетически ценных коров. Такая методика обеспечит и более дешевое получение в достаточном количестве зигот и ранних эмбрионов, необходимых для переноса ядер и рекомбинантных ДНК, а также для получения трансгенных животных.

Первый теленок из дозревшего «в пробирке» фолликулярного ооцита после его экстракорпорального оплодотворения родился в 1983 году (Л.К. Эрнст и соавт.). Исследователи для этой цели использовали ооциты, созревшие in vitro , и некапацитированные свежие или замороженно-оттаянные сперматозоиды. Каждому реципиенту – телке хирургическим методом трансплантировали в яйцепровод по 1-7 эмбрионов, находящихся на 2-4-клеточной стадии дробления. Одному реципиенту пересадили 3 четырех клеточных эмбриона, полученных от экстракорпорального оплодотворения in vitro созревших фолликулярных ооцитов, взятых из яичников двух- и одномесячных телочек и одной половозрелой коровы. В результате такой трансплантации и родился живой теленок. Однако хирургическая трансплантация находящихся на первых стадиях развития эмбрионов в яйцепровод реципиента существенно усложняет биотехнологию трансплантации. Поэтому очень важно получение эмбрионов на стадиях морулы или бластоцисты, пригодных для трансплантации нехирургическим способом.

Л.К.Эрнст и соавт. (1987) использовали яйцевод кролика для обеспечения ранних стадий развития эмбрионов коров как после оплодотворения in vitro, так и после оплодотворения в яйцеводе кролика (1987). Они извлекали ооциты из фолликулов и культивировали в среде 199 с 20% фетальной сывороткой плода при добавлении эстрадиола, прогестерона, тестостерона и лютеинизирующего гормона в течение суток при 38°С во влажной камере, содержащей 5% СО 2, 5% О 2 и 90% N 2 . Капацитацию сперматозоидов проводили в среде с высокой ионной силой и в яйцеводе эстрального кролика за 4-5 ч до пересадки ооцитов. Через 19-20 ч после соединения яйцеклеток со сперматозоидами в яйцеводе кролика или in vitro ооциты пересаживали в лигатированный яйцевод ложнобеременного кролика для дальнейшего их развития на 4-5 суток. Оплодотворяемость при этом была 22-25%. Через 3 суток процент эмбрионов, достигших стадии морулы после оплодотворения в яйцеводе кролика, примерно в 4 раза превышает аналогичный показатель после оплодотворения в условиях in vitro. На 4 и 5 сутки эта разница несколько уменьшается, но по-прежнему остается значительной в пользу ооцитов, оплодотворенных в яйцеводе кролика.  Это свидетельствует о том, что в яйцеводе кролика создаются более благоприятные условия для капацитации сперматозоидов быка и оплодотворения ооцитов, чем в известных пока культуральных средах. В результате хирургической и нехирургической трансплантации эмбрионов коров на стадии морулы было получено 6 стельностей, в том числе одна двойневая (5 из 6 стельностей дали ооциты, взятые из яичников коров, убитых на мясокомбинате). Родились по 2 живых теленка из ооцитов, оплодотворенных в яйцеводе кролика и “в пробирке”. Один теленок родился в результате нехирургической пересадки эмбриона, полученного после оплодотворения in vitro. Приживляемость эмбрионов, полученных в результате оплодотворения ооцитов в яйцеводе кролика, была почти в 6 раз выше, чем в случаях оплодотворения “в пробирке”.

Для развития эмбрионов крупного рогатого скота до стадии морулы и бластоцисты Crister et al. (1986) использовали лигатированные яйцеводы овцы. Весомых успехов в оплодотворении in vitro ооцитов коров достигли и ирландские ученые (Lu et al., 1987; 1988). В качестве временного реципиента для оплодотворенных клеток они использовали также яйцевод овцы. 80% ооцитов дробились до 2-клеточной стадии и выше, и почти половина из них достигла стадии морулы и бластоцисты.

Эксперименты по оплодотворению овец проводились по двум направлениям: “в пробирке” и введением фолликулярных ооцитов в яйцевод осемененной овцы. Как и у коров, эффективность оплодотворения ооцитов была выше, когда фолликулярные и овулировавшие клетки помещали в яйцевод со сперматозоидами, чем при использовании системы in vitro. Причем исследователи существенной разницы в развитии ооцитов до стадии бластоцист в случаях культивирования яйцеклеток in vitro и in vivo (в фолликулах) не наблюдали. В меньшей степени изучены вопросы оплодотворения “в пробирке” у свиней. Polge (1977) описал проникновение сперматозоидов в ооциты после созревания их in vitro и пересадки в яйцевод осемененной эстральной свиньи. Однако ни одна яйцеклетка не развилась до стадии бластоцисты, и у многих из них проявилась полиспермия.

Культивирование in vitro эмбрионов сельскохозяйственных животных. Видовая сыворотка крови была первой средой, которая испытывалась на пригодность для культивирования эмбрионов коров и овец. В этой среде развитие оплодотворенных клеток ограничивалось одним делением и прекращалось после 48 ч культивирования.

О возможности использования фолликулярной жидкости для культивирования эмбрионов сообщил Thibault в 1966 году. Он наблюдал в этой среде развитие зародыша коров с 1-4 клеточных бластомеров до морулы. Tervit et al. (1972) испытали синтетическую яйцеводную жидкость (СЯЖ). По данным авторов, 9% 8-клеточных бластомеров овец развивались до стадии ранней бластоцисты после 6-дневного культивирования в СЯЖ в атмосфере, состоящей из 5% СО 2, 5% О 2 и 90% N 2. Более половины 8-клеточных эмбрионов, культивируемых в СЯЖ в течение 3 дней, после пересадки прошли путь онтогенеза до рождения потомства. Однако авторам не удалось получить стельности после культивирования одноклеточных эмбрионов. Bowan et al . (1975) отметили преимущественное развитие эмбрионов в средах СЯЖ и ХЭМ Ф-10 с осмотическим давлением 270 мосм по сравнению с 300 мосм. Последняя среда с добавлением фетальной сыворотки, по мнению ряда ученых, является наиболее благоприятной средой для культивирования эмбрионов “в пробирке”. Например, Wright et al. в 1976 году в среде ХЭМ Ф-10 наблюдали развитие эмбрионов коров с 1-2 клеточных бластомеров до вылупившейся бластоцисты. В следующем году Peters et al. аналогичных результатов достигли при использовании Среды Виттена с добавлением 0,5% бычьего сывороточного альбумина. Они также отметили, что “в пробирке” развитие 1-4-клеточных эмбрионов ограничено по сравнению с 8-клеточными. Эта среда, но с повышенным содержанием бычьего сывороточного альбумина (15%) оказалась оптимальной для культивирования эмбрионов свиньи (Linder, Wright, 1978).

В настоящее время научные поиски в области оплодотворения с.-х. животных “в пробирке” получают дальнейшие развития. Они направлены на исключение из этой технологии временного реципиента (яйцеводы кролика, овцы и др.) для развития ранних эмбрионов. Подходящей заменой временного реципиента может быть монослой яйцеводных и грануляционных клеток.

Контрольные вопросы: 1.В чем состоит практическая значимость техники оплодотворения вне организма?; 2. Расскажите о результатах исследований по совершенствованию процесса созревания яйцеклеток вне организма; 3. Принципы и подходы, используемые в оплодотворении вне организма.

Лекция №8

Проблемы генной инженерии в создании трансгенных животны х

Для выведения улучшенных пород домашних животных и птиц (коров с более высокой удой­ностью, овец с качественной шерстью, кур с более высокой яйценоскостью и т. д.) проводят множество раундов скрещиваний и отбора, ка­ждый раз используя в качестве производителей животных с наилучшими характеристиками. В результате со временем можно получать более или менее чистые линии высокопродуктивных пород животных. Стратегия скрещивания и от­бора, требующая больших временных и матери­альных затрат, оказалась тем не менее исклю­чительно успешной, и сегодня почти все аспекты биологических основ выведения но­вых пород домашнего скота могут быть к ней сведены. Однако после того как эффективная генетическая линия получена, вводить новые признаки методом скрещивания и отбора ста­новится все труднее. Так, линия с новым «цен­ным» геном может нести также и «вредные» ге­ны, вследствие чего потомки могут оказаться менее продуктивными. Чтобы быть уверенны­ми в том, что новая, улучшенная линия сохра­нит исходные полезные признаки и приобретет новые, необходимо разработать абсолютно но­вую стратегию. 

 Для создания трансгенных линий животных решающее значение в животноводстве имеет получение таких особей, у которых все или часть половых клеток имеют трансген. Исследования родившихся трансгенных животных и полученного от них потомства показали, что, несмотря на введение ДНК на ранних стадиях (в пронуклеус оплодотворенного ооцита), могут появляться мозаики. Мозаики - это животные, состоящие из двух или нескольких клеточных линий, происходящих из одной зиготы, но имеющие различные генотипы. Такие животные, кроме клеточных линий с трансгеном, имеют нетрансгенные клеточные линии. Поэтому, если половые клетки не содержат трансген, потомство не может наследовать чужеродный ген от трансгенной родительской формы. Установлено, что примерно 30% первичных трансгенных животных являются мозаиками. В этой связи трансген не передается потомству согласно законам Менделя с частотой 50%. Часть мозаиков вообще не может дать начало трансгенным линиям, так как у них отсутствует передача по наследству.

Трансгенные технологии разрабатывались и со­вершенствовались на лабораторных мышах. С начала 1980-х гг. в различные линии мышей были введены сотни генов. Эти исследования в зна­чительной мере способствовали установлению механизмов генной регуляции и развития опухо­лей, природы иммунологической специфично­сти, молекулярной генетики роста и развития, других фундаментальных биологических процес­сов. Трансгенные мыши сыграли свою роль в ис­следовании возможности крупномасштабного синтеза лекарственных веществ, а также в созда­нии трансгенных линий, позволяющих модели­ровать различные генетические болезни челове­ка. Введение чужеродной ДНК мышам осуществлялось разными методами: 1) с помощью ретровирусных векторов, инфицирующих клетки эмбриона на ранних стадиях развития перед им­плантацией эмбриона в самку-реципиента; 2) микроинъекцией в увеличенное ядро спермия (мужской пронуклеус) оплодотворенной яйце­клетки; 3) введением генетически модифицированных эмбриональных стволовых клеток в предимплантированный эмбрион на ранних стадиях развития.

Использование ретровирусных векторов. Преимущество метода, основанного на исполь­зовании ретровирусных векторов, пе­ред другими методами трансгеноза состоит в его эффективности. Однако размер вставки в этом случае ограничивается 8 т. п. н., вследствие чего трансген может оказаться лишенным прилегаю­щих регуляторных последовательностей, необ­ходимых для его экспрессии.

Использование ретровирусных векторов имеет и еще один большой недостаток. Хотя эти векторы создаются так, чтобы они были дефект­ными по репликации, геном штамма ретровиру­са (вируса-помощника), который необходим для получения большого количества векторной ДНК. может попасть в то же ядро, что и трансген. Несмотря на все принимаемые меры, ретровирусы-помощники могут реплицироваться в организме трансгенного животного, что совер­шенно недопустимо, если этих животных пред­полагается использовать в пищу или как инстру­мент для получения коммерческого продукта. И поскольку существуют альтернативные методы трансгеноза, ретровирусные векторы редко ис­пользуются для создания трансгенных живот­ных, имеющих коммерческую ценность.

Метод микроинъекций ДНК. В настоящее время для создания трансгенных мы­шей чаще всего используют метод микроинъекций ДНК. Он заключается в следующем. Работу начинают со стимуляции гиперовуляции у самок-доноров с целью увеличения числа яйцеклеток, в которых бу­дет инъецирована чужеродная ДНК. Сначала самкам вводят сыворотку бере­менной кобылы, а спустя примерно 48 ч — хорионический гонадотропин человека. В результате гиперовуляции образуется при­мерно 35 яйцеклеток вместо обычных 5—10. Затем производят скрещивание с самцами самок с гиперовуля­цией, после чего их умерщвляет, вымывают из яйце­водов оплодотворенные яйцеклетки, и сразу инъецируют ДНК в оплодотворенные яй­цеклетки. Часто вводимая трансгенная конструкция нахо­дится в линейной форме и не содержит прокариотических векторных последовательностей.

У млекопитающих после проникновения сперматозоида в яйцеклетку ядро спермин (муж­ской пронуклеус) и ядро яйцеклетки существуют раздельно. После того как последнее заканчивает митотическое деление и становится женским пронуклеусом, может произойти слияние ядер (кариогамия). Мужской пронуклеус обычно го­раздо больше женского, его легко локализовать с помощью секционного микроскопа и ввести в него чужеродную ДНК. При этом яйцеклетку на время проведения микроинъекции можно пере­мещать, ориентировать нужным образом и фик­сировать. Опытный экспериментатор за день мо­жет инокулировать несколько сотен яйцеклеток.

После введения ДНК от 25 до 40 яйцеклеток имплантируют микрохирургическим путем в «сур­рогатную» мать, у которой вызывают ложную бе­ременность скрещиванием с вазэктомированным самцом. У мышей спаривание — это единствен­ный известный способ подготовки матки к им­плантации. Поскольку вазэктомированный самец сперматозоидов не продуцирует, ни одна из яйце­клеток «суррогатной» матери не оплодотворяется. Эмбрионы развиваются только из введенных яй­цеклеток, и мышата рождаются спустя примерно 3 нед после имплантации.

Для идентификации трансгенных животных выделяют ДНК из маленького кусочка хвоста и тестируют ее на наличие трансгена с помощью блот-гибридизации по Саузерну методом ПЦР. Чтобы опре­делить, находится ли трансген в клетках зароды­шевой линии животного, трансгенную мышь скрещивают с другой мышью. Далее можно про­водить скрещивание потомков для получения чистых (гомозиготных) трансгенных линий.

Описанный подход кажется на первый взгляд относительно простым, однако он требует четкой координации разных этапов. Даже высококвали­фицированному специалисту удается получить жизнеспособных трансгенных животных в луч­шем случае лишь из 5% инокулированных яйце­клеток. Ни один из этапов экспери­мента не эффективен на все 100%, поэтому для микроинъекций необходимо использовать большое число оплодотворенных яйцеклеток. На­пример, при получении трансгенных мышей после инъекции ДНК выживают только 66% оп­лодотворенных яйцеклеток; мышата развива­ются примерно из 25% имплантированных яй­цеклеток, причем трансгенными из них оказываются лишь 25%. Таким образом, из 1000 имплантированных оплодотворенных яйцекле­ток развивается от 30 до 50 трансгенных мышат. Кроме того, введенная ДНК может интегриро­вать в любое место в геноме, и зачастую множе­ство ее копий включаются в один сайт. И, нако­нец, не все трансгенные мышата будут обладать нужными свойствами. В организме некоторых особей трансген может не экспрессироваться из-за неподходящего окружения сайта интегра­ции, а в организме других число копий чуже­родного гена может оказаться слишком боль­шим, что может привести к гиперпродукции белка и нарушению нормальных физиологиче­ских процессов. И все же, несмотря на все это, метод микроинъекций используют для получе­ния линий мышей, несущих функциональные трансгены, довольно часто.

Использование модифицированных эмбриональных стволовых клеток. Клетки, выделенные из мышиных эмбрионов на стадии бластоцисты, могут пролиферировать в культуре, сохраняя способность к дифференцировке в любые типы клеток, в том числе и в клетки зародышевой линии, при введении в другой эмбрион на стадии бластоцисты. Такие клетки называются плюрипотентными эмбрио­нальными стволовыми клетками ( ES ). ES-клетки в культуре легко модифицировать методами генной инженерии без нарушения их плюрипотентности. Например, в определенный сайт не­существенного гена в их геноме можно встроить функциональный трансген. Затем можно ото­брать измененные клетки, культивировать их и использовать для получения трансгенных жи­вотных. Это позволяет избежать слу­чайного встраивания, характерного для метода микроинъекций и ретровирусных векторных си­стем.

При трансфекции ES-клеток в культуре век­тором, предназначенным для интеграции в спе­цифический хромосомный сайт, в некоторых клетках ДНК встраивается случайным образом, в других встраивание происходит в нужный сайт, в большинстве же ES-клеток интеграции вообще не происходит. Для увеличения числа клеток первого типа используют так называе­мую позитивно-негативную селекцию. Эта стратегия состоит в позитивной селекции кле­ток, несущих векторную ДНК, встроившуюся в нужный сайт, и негативной селекции клеток с векторной ДНК, интегрировавшей в случайный сайт.

Сайт-мишень должен находиться в такой об­ласти геномной ДНК, которая не кодирует важ­ных белков, чтобы интеграция чужеродной ДНК не повлияла на процессы развития или клеточ­ные функции. Кроме того, существенно, чтобы встраивание трансгена не блокировало трансля­цию соответствующего участка генома. Поиск подобных сайтов ведется непрерывно.

Более простой способ идентификации ES -клеток, несущих трансген в нужном сайте, осно­ван на использовании ПЦР. В этом случае ДНК-вектор содержит два участка, гомологичных сайту-мишени, по одному со стороны трансгена и со стороны клонированной бактериальной или синтетической (уникальной) последова­тельности, отсутствующей в геноме мыши. После трансфекции ES -клеток этим век­тором проводят скрининг трансфицированных клеток методом ПЦР. Один из ПЦР-праймеров комплементарен участку клонированной бактериальной или синтетической (уникаль­ной) нуклеотидной последовательности интег­рировавшего вектора, а второй - участку хромосомной ДНК, прилегающему к одному из гомологичных участков ДНК. При встраивании последовательности-мишени в случайный сайт ожидаемый продукт амплификации образовы­ваться не будет, а при сайт-специ­фической интеграции в результате ПЦР-ампли­фикации образуется фрагмент ДНК известного размера. Таким образом можно идентифицировать пулы ES-клеток, содержа­щих трансген в нужном сайте, а пересевая клет­ки из этих пулов — получить клеточные линии с сайт-специфической вставкой.

ES-клетки, в геном которых в нужном сайте встроен трансген, можно культивировать и ввести в эмбрион на стадии бластоцисты, а затем им­плантировать такие эмбрионы в матку псевдобе­ременных «суррогатных» матерей. Мышата, у которых генетически модифицированные ES-клетки участвовали в образовании клеток заро­дышевой линии, могут дать начало трансгенным линиям. Для этого их нужно скрестить с особями той же линии, а затем скрестить их трансгенных потомков. В результате будут получены транс­генные мыши, гомозиготные по трансгену.

В принципе подходы к созданию трансген­ных животных с «улучшенными функциями» и с «потерей функций» сходны. К сожалению, плюрипотентные ES-клетки, аналогичные таковым у мышей, пока не обнаружены у крупного рога­того скота, овец, свиней и цыплят, но их поиск продолжается.

Трансгенные мыши могут служить модельными системами для изучения болезней человека и тест-системами для исследования возможности синтеза продуктов, представляющих интерес для медицины. Используя целых животных, можно моделировать и возникновение патологии, и ее развитие. Однако мышь — не человек, хотя она тоже относится к классу млекопитающих, поэто­му данные, полученные на трансгенных моделях, не всегда можно экстраполировать на человека в том, что касается медицинских аспектов. Тем не менее, в некоторых случаях они позволяют вы­явить ключевые моменты этиологии сложной бо­лезни. Принимая во внимание все это, ученые разработали «мышиные» модели таких генети­ческих болезней человека, как болезнь Альцгеймера, артрит, мышечная дистрофия, образова­ние опухолей, гипертония, нейродегенеративные нарушения, дисфункция эндокринной сис­темы, сердечно-сосудистые заболевания и многие другие.

Для создания трансгенных коров исполь­зуют модифицированную схему трансгено­за мышей методом микроинъекций ДНК. Процедура включает следующие основные этапы: сбор ооцитов коров, забитых на скотобойне; созревание ооцитов in vitro ; оплодотворение бычьей спермой in vitro ; центрифугирование оплодотворенных яйце­клеток для концентрирования желтка, кото­рый в нормальных яйцеклетках мешает визу­ализации мужского пронуклеуса с помощью секционного микроскопа; микроинъекция ДНК в мужской пронуклеус; развитие эмбрионов in vitro ; нехирургическая имплантация одного эмб­риона реципиентной самке во время течки; скрининг ДНК потомков на наличие транс­гена.

 Перенос генов у сельскохозяйственных животных может быть использован в улучшении продуктивности и качества животноводческой продукции, повышении устойчивости к болезням и создании трансгенных животных - биореакторов ценных биологически активных веществ. Эрнст Л.К. (1996) сообщает, что у трансгенных свиней с геном гормона роста конечная живая масса была на 15,7% выше, чем у контрольных животных. По данным Брем Г. и др. (1991), у потомства трансгенных свиней, получавших соответствующий модифицированный кормовой рацион с повышенным содержанием протеина и дополнительным количеством лизина, отмечались более высокие среднесуточные привесы. В противоположность этим результатам нередки случаи эспрессии трансгенов без фенотипического эффекта. Это выяснилось уже в первой работе (R.E.Hammer et al., 1985) - при переносе гена гормона роста человека, когда были получены трансгенные кролики, свиньи и овцы, но ни в одном из случаев экспресии гормона роста человека не наблюдалось каких-либо фенотипических изменений у животных. V . G . Pursel et al . (1987) с этим же геном получили поросят с установленной экспрессией этого гена, но также без изменения скорости роста. Эти же исследователи (1988;1989) у трансгенных свиней с геном гормона роста также не регистрировали соответствующего ускорения роста. Трансгенные овцы с геном гормона роста имели повышенный его уровень, но не отличались от контрольных по интенсивности роста. Однако трансгенные свиньи имели более чем двукратное уменьшение толщины шпика, а у трансгенных овец содержание жира было примерно в 4-5 раз меньше, чем у контрольных аналогов. В связи с этим был высказан ряд предложений, одно из которых связывает отсутствие специфического фенотипического эффекта у животных со слабым узнаванием его рецепторами молекул чужеродного гормона или с посттрансляционными модификациями (K.A.Ward, C.D.Nancarrow, 1991). Это предположение вскоре получает экспериментальное доказательство на активно растущих свиньях, в геном которых были встроены дополнительные копии гена собственного гормона роста (V.D.Vize et al., 1988). Однако последующие опыты на овцах дали другой результат. Надежды на то, что в организме овцы ее собственный ген будет “работать” лучше, чем чужеродный, не оправдались. Трансгенные овцы с высоким содержанием овечьего гормона роста демонстрировали слабый прирост живой массы и были физиологически ненормальны.

Разницу по скорости роста между трансгенными мышами и трансгенными с.-х. животными некоторые исследователи объясняют следующим образом. Большинство свиней, использованных в экспериментах по переносу генов, происходили из популяций, в которых длительное время велась селекция по ростовой продуктивности, тогда как в линии мышей не велся отбор по этому показателю. Действительно, мыши, в популяции которых в течение 30 поколений осуществлялась селекция по скорости роста, имели незначительно меньшую живую массу по сравнению с трансгенными сверстниками. Следовательно, введение чужеродного гена в популяцию линий мышей, не подвергнутых селекции на скорость роста, вызывает скачок на более высокий ростовой уровень. Генетический потенциал роста в популяциях свиней, наоборот, находится недалеко от потенциального плато, и поэтому дополнительное введение гормона роста или перенос его гена не дает значительного эффекта в скорости роста. Другое объяснение отсутствия ускорения роста трансгенных животных связывают с необходимостью увеличения не только гормона роста, но и каких-то других, пока не известных стимуляторов роста.

Нерегулируемая экспрессия гена гормона роста, как аутологичного, так и гетерологичного, может привести к сокращению продолжительности жизни трансгенных животных вследствие патологических нарушений обмена веществ, развития акромегалии (чрезмерное разрастание отдельных частей лица, конечностей и внутренних органов) и подверженности различным инфекционным заболеваниям. Например, у трансгенных овец с повышенным содержанием в крови гормона роста крупного рогатого скота развился сахарный диабет - типичный симптом акромегалии (С.E. Rexroad et al., 1990). В другой работе сахарный диабет был отмечен у трансгенных овец, активно экспрессирующих собственный гормон роста. Животные пали в течение первого года постнатальной жизни (C.D.Nancarraw et al., 1991; K.A.Ward et al., 1989). Трансгенные свиньи с гиперсекрецией гормона были меньше по живой массе при рождении, чем однопометное потомство, более вялые, с угнетенным аппетитом, склонностью к артритам, и большинство из них также не жило больше года (V.G.Pursel et al., 1987, 1989). Стало очевидным, что постоянно высокий уровень продукции гормона роста у животных не является положительным фактором их продуктивности. Анализ этих экспериментов свидетельствует о том, что использование трансгенной технологии для изменения роста и состава тканей домашних животных требует углубления понимания процессов генетической регуляции роста. По мнению Л.К.Эрнста и соавт. (1993), направленное воздействие на один гормон комплексного гормоноростового каскада не будет эффективным, пока не будут созданы сложные конструкции генов с тонкой регуляцией процессов метаболизма.

Создание трансгенных животных открывает реальные перспективы улучшения качества или состава продуктов животноводства. Например, появилась возможность уменьшения лактозы в молоке путем создания трансгенных коров и овец, которые имеют специфический для молочной железы промотор (участок ДНК, с которым связывается РНК-полимераза, чтобы начать синтез мРНК), сцепленный с геном лактозы. При этом уже в молоке коров (овец) лактоза может быть расщеплена на глюкозу и галактозу. Такое молоко могло бы быть использовано в питании новорожденных детей, страдающих наследственной непереносимостью лактозы. Таким детям в грудном возрасте молоко следует давать только после его обработки ферментными препаратами. Кроме того, молоко могло бы быть полезно при различных желудочно-кишечных заболеваниях человека, сопровождающихся снижением активности лактазы (бета-галактозидазы). Наличие в молоке разнообразной микрофлоры создает проблемы, связанные с хранением, переработкой, потреблением молока и здоровьем животных. В этой связи конструируются гены, ответственные за выработку антител против определенных патогенных микроорганизмов (R.D.Bremel et al., 1989; U.H. Weidle et al., 1991). Важной задачей является и получение молока и молочных продуктов, содержащих термостабильный фермент лизоцим микробного происхождения. При пастеризации молока такой фермент, обладающий выраженным антибактериальным свойством, не потеряет своей активности, что значительно увеличит сроки хранения молока и получаемых из него продуктов. В кислой среде желудочно-кишечного тракта лизоцим инактивируется. Рассматривается возможность введения генов, кодирующих антитела с протективными свойствами в отношении патогенных микробов - возбудителей маститов коров.

Сотрудниками Института цитологии и генетики СО РАН (г.Новосибирск) и Института молекулярной генетики РАН (г.Москва) создана генетическая конструкция pGoatcasGMCSF, которая содержала регуляторный район гена альфа-S1-казеина козы, несущая ген гранулоцит-макрофаг колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) человека (И.А.Серова и соавт., 2011). В экспериментах по инъекции этой рекомбинантной ДНК в пронуклеусы зигот были получены 4 трансгенных мыши. Методом ПЦР показана тканеспецифичность экспрессии ГМ-КСФ человека только в молочной железе лактирующих самок. Поскольку упомянутая конструкция является тканеспецифичной, она подпадает под регуляцию физиологических сигналов беременности и лактации. 

Достижения генной инженерии могут быть использованы в изменении качества и выхода шерсти овец. Дальнейшее усовершенствование шерстных характеристик овец в определенной степени зависит от степени снабжения волосяных фолликулов питательными веществами, необходимыми для их активного функционирования. Главным препятствием физиологи считают ограничение запаса энергии для обеспечения процессов клеточной пролиферации и аминокислот (лизина, метионина, аргинина, гистидина и цистеина) для синтеза кератинов фибринов шерсти. Ферментативные процессы, вызываемые микрофлорой рубца, не всегда полностью обеспечивают синтез необходимых аминокислот, так как при расщеплении протеинов корма большая часть их уходит на синтез микроорганизмами собственных белков, что снижает уровень важных для роста шерсти аминокислот. Поэтому первоочередной задачей технологии рекомбинантных ДНК, направленной на улучшение характеристик шерсти овец, является увеличение эффективности усвоения корма овцами. 

С целью увеличения количества серусодержащих аминокислот (например цистеина), необходимых для биосинтеза кератиновых белков шерсти овец, Rogers G.E. (1990) считает целесообразным создание трансгенных овец, имеющих в своем геноме бактериальные гены, кодирующие синтез цистеина. Эти гены должны экспрессироваться только в эпителии желудочно-кишечного тракта овцы и обусловливать использование серы, образующейся в результате ферментативных процессов микроорганизмов. Им получен первый трансгенный ягненок, содержащий в своем геноме гены серинацетилтрансферазы (SAT) и О-ацетилсеринсульфгидрилазы (OAS) из Salmonella typhimurium. K . A . Ward et al . (1990) использовали SAT и OAS кишечной палочки, соединенные с генной конструкцией, состоящей из промотора металлотионина-1а овцы, вызывающего цинкзависимую экспрессию. Исследования в этом направлении продолжаются. 

Все более важное значение приобретает селекция животных по устойчивости к заболеваниям. В отличие от вакцинации, эффект действия которой проявляется в течение жизни конкретных индивидуумов, генно-инженерный иммунитет может иметь наследственный характер, что позволит вывести линии с.-х. животных, резистентных к определенным инфекционным болезням. Резистентность к ряду заболеваний является полигенным признаком. Например, устойчивость к трипаносомозу определенных африканских пород крупного рогатого скота наблюдается на фоне их жаровыносливости и нетребовательности к условиям кормления и содержания. Вместе с тем резистентность организма может основываться и на единичных генах. В качестве примера можно привести устойчивость к диарее у новорожденных поросят или резистентность к гриппу у мышей. Это послужило основанием для получения животных с трансгенами, которые, возможно, создадут иммунитет к отдельным инфекционным заболеваниям. В этом направлении генно-инженерных работ на первый план выступают исследования специфического антивирусного эффекта генов моноклональных антител. Механизм действия последних должен быть в известной степени аналогичен специфической антивирусной иммунизации животных. Получены трансгенные мыши, продуцирующие антитела против специфических антигенов без предварительной иммунизации или контакта с инфекцией (Storb U., 1987). Гены легкой и тяжелой цепей моноклональных антител против 4-гидрокси-3-нитрофенилацетата были интегрированы в геном кроликов и свиней (U.Weidle et al., 1991). Титр специфических антител в сыворотке крови трансгенных животных оказался равным соответственно 100 и 1000 мкг/мл. Имеются сообщения о получении трансгенных мышей, овец и свиней с генными конструкциями, кодирующими альфа- и хи-цепи антител против фосфорилхолина (D.Lo et al., 1991). Авторы наблюдали высокий уровень IgA мыши, но только у трансгенных мышей и свиней. Г.Брем и др. с 1991 года выделили и клонировали ген мышей Мх, ответственный за иммунитет к вирусу гриппа А, и ведут работу по получению трансгенных свиней на основе использования данного гена. Исследуется возможность получения трансгенных животных, имеющих повышенную концентрацию лактоферина в тканях молочной железы, с целью повышения устойчивости к маститу. Ведутся работы и по получению животных, имеющих в своем геноме трансген антисмысловой РНК. Экспрессия последней в клетках приводит к гибридизации со смысловой РНК, в результате чего подавляется репликация вирусного гена. Так, российскими учеными (Т.И. Тихоненко, М.И. Прокофьев., Л.К. Эрнст., 1991) был сконструирован ген антисмысловой РНК против аденовируса и получены трансгенные кролики. Клеточные линии животных (культура клеток из почек), имеющие трансген, показали высокую резистентность против аденовируса по сравнению с контрольными линиями клеток. Эти же исследователи продемонстрировали устойчивость животных с трансгеном антисмысловой РНК против лейкоза крупного рогатого скота на организменном уровне к заражению вирусом - возбудителем этой болезни. Так, у трансгенных кроликов с упомянутым геном титр антител против антигена р24 был значительно ниже (1:500), чем у контрольных животных (1:8000). Показана возможность создания внутриклеточной иммунизации против некоторых вирусов. Получены трансгенные куры, клетки которых экспрессировали капсидный белок вируса лейкоза, что и способствоало  устойчивости их к этой болезни. 

Известно о существовании пород с наследственной устойчивостью к бакте­риальным инфекционным заболеваниям — мас­титу (коровы), дизентерии (новорожденные по­росята), холере (домашняя птица). Если в основе устойчивости к каждой из этих болезней лежит один ген, можно попытаться создать не­сущих его трансгенных животных. В настоящее время для борьбы с инфекционными заболева­ниями домашних животных используют при­вивки и лекарственные препараты. Заболевших животных изолируют, за здоровыми ведут тща­тельное наблюдение. Стоимость всех этих меро­приятий может достигать 20% общей стоимости конечной продукции.

Для выведения линий животных, устойчивых к возбудителям инфекций, можно использовать другой подход, заключающийся в создании пу­тем трансгеноза наследуемых иммунологиче­ских механизмов. С этой точки зрения рассмат­ривают самые разные гены, ответственные за работу иммунной системы: гены основного комплекса гистосовместимости, Т-клеточных рецепторов, лимфокинов. Наиболее обнадежи­вающими на настоящее время являются предва­рительные результаты, полученные при введе­нии мышам, кроликам и свиньям генов, кодирующих Н- и L -цепи какого-либо моноклонального антитела. Идея этого подхода за­ключается в том, чтобы снабдить трансгенное животное наследуемым механизмом защиты, позволяющим обойтись без иммунизации с по­мощью прививок.

Введение в организм реципиента генов ан­тител, которые связываются со специфиче­скими антигенами, было названо иммуниза­цией in vivo . Для этого гены Н- и L -цепей иммуноглобулинов моноклонального мышиного антитела к антителу, связывающемуся с 4-гидрокси-З-нитрофенилацетатом, вводили с помощью микроинъекций в оплодотворенные яйцеклетки мыши, кролика и свиньи. Во всех случаях в сыворотке трансгенных животных обнаруживалась соответствующая активность моноклонального антитела. Однако количест­во моноклональных антител, содержащих це­пи Н- и L -, было невелико. Чтобы установить, можно ли решить эту проблему, необходимо протестировать различные трансгенные кон­струкции.

Возможность включения в клетки организма генов, ответственных за синтез белков, имеющих большую значимость в медицине и ветеринарии, создало основу стратегии использования трансгенных животных в качестве биореакторов. Большинство таких белков и по сей день выделяются из тканей и биологических жидкостей человека. Например, фактор свертываемости, интерферон, альфа-1-антитрипсин и другие белки получают из крови, гормон роста - из гипофиза. Они производятся в малых количествах из-за дороговизны и трудности выделения человеческих тканей. Кроме того, они могут быть заражены патогенными микроорганизмами, такими как возбудители гепатита, СПИДа и др.

Трансгенные животные, используемые для производства ценных биопрепаратов, имеют ряд преимуществ перед микроорганизмами-продуцентами, а также клеточными системами. В простых рекомбинантных системах микроорганизмов гликолизирование, В-гидроксилирование или карбоксилирование белков млекопитающих в большинстве случаев невозможно или возможно, но с недостаточной точностью. Это приводит к изменению структуры белков, что не может не отразиться на их биологической активности. Наряду с этим в препаратах, используемых человеком в качестве лечебных средств, нежелательна примесь бактериальных белков. Основным недостатком генно-инженерных культуральных клеток является низкий выход белка. Промышленные реакторы, используемые для культивирования клеток-продуцентов, являются дорогими, как в отношении их стоимости, так и в отношении их обслуживания. Создание трансгенных животных также требует больших средств и к тому же дело не из легких, но однажды выведенная линия таких животных может продуцировать большое количество белков с низкой стоимостью, что позволит окупить все расходы за короткое время. Получение биологически активных белков человека от трансгенных с.-х. животных гарантирует их экологическую чистоту и экологическую чистоту самого производства, которое практически сводится к эксплуатации животных-продуцентов.

Чужеродные белки могут быть синтезированы большинством тканей тела животного. Экспрессии трансгенов в определенных органах можно достичь путем комбинации структурных генов со специфическими регуляторными элементами. Весомые успехи в производстве биореакторов были достигнуты в целенаправленной экспрессии трансгенов в эпителиальных клетках молочной железы. Структурный ген, связанный с промотором гена молочного протеина (казеина, лактоальбумина, лактоглобулина), в первую очередь будет экспрессироваться в клетках молочной железы. Это позволяет получать полезную продукцию с молоком.  

Выбор молочной железы как места производства чужеродных протеинов обосновывается огромной ее белковой продуктивностью. Общее содержание молочных белков в зависимости от вида животного колеблется в пределах 2-10%, т.е. на уровне 20-100 граммов на литр. Для коммерческого производства белков, имеющих фармацевтическую значимость, уже достаточно одного и более граммов рекомбинантного белка. Наиболее эффективным «биореактором» является крупный рогатый скот, который еже­годно при удое 5 тыс л. молока, может давать примерно 35 г белка на 1 л. Если в молоке будет содержаться такое количество рекомбинантного белка и эффективность его очистки составит 50%, то от 20 трансгенных коров можно будет получать 50 кг такого белка в год. Образно говоря, достаточно по две коровы для того, чтобы полностью удовлетворить годовую потребность в белке С, использующегося для предотвращения тромбообразования, и фактора IX - (фактора Кристмаса) каскадного механизма свертывания крови.

 На сегодняшний день известен ряд рекомбинантных белков, таких как человеческий белок С, антигемофильный фактор 1Х, альфа-1-антитрипсин, тканевой плазменный активатор, лактоферин, человеческий сывороточный альбумин, интерлейкин-2, урокиназа, химозин и др., полученных из молока трансгенных животных. Работы по получению указанных белков, за исключением альфа-1-антитрипсина и химозина, находятся на уровне лабораторных исследований и не достигли стадии, которая бы представляла коммерческий интерес. Одна из целей трансгеноза крупного рогато­го скота — изменение содержания в молоке раз­личных компонентов. Так, количество сыра, по­лучаемого из молока, прямо пропорционально содержанию в нем к-казеина, поэтому весьма перспективным представляется увеличение ко­личества синтезируемого к-казеина с помощью гиперэкспрсссии трансгена этого белка.

В 1992 году ученые Великобритании получили трансгенных овец - продуцентов человеческого альфа-1-антитрипсина, используемого для лечения людей, больных эмфиземой легких. Этот препарат получают исключительно из донорской крови (1г альфа-1-антитрипсина стоит 110 долл.США). У четырех голов концентрация данного белка была в пределах 1 г/л, а у одной достигала 35 г/л, что соответствует половине всех белков в молоке. При таком уровне продукции одна овца в год даст столько белка, сколько необходимо для лечения 50 пациентов.

Российские ученые (Л.К.Эрнст, Г.Брем, М.И.Прокофьев, И.Л.Гольдман и др.) получили трансгенных овец, секретирующих с молоком фермент химозин в концентрации 200-300 мг/1л. Химозин - основной компонент в производстве сыра, получаемый из сычугов молочных телят и ягнят. При этом стоимость химозина, получаемого из нового источника, будет дешевле в 5-10 раз. По расчетам авторов из трех литров молока трансгенной овцы можно получить такое количество фермента, которое достаточно для производства одной тонны сыра из коровьего молока.

Экспрессия трансгенов в клетках молочных желез овец и коз не оказыва­ла никаких побочных действий ни на самок в период лактации, ни на вскармливаемое потом­ство. В отличие от этого при введении свиньям трансгена бычьего гормона роста под контролем промотора металлотионина неблагоприятные эффекты наблюдались. Количество гормона у разных особей в группе трансгенных свиней различалось, однако в целом вся эта группа бы­стрее прибавляла в весе. К сожалению, этот по­ложительный результат частично обесценивался различными патологиями: у животных отмеча­лись язва желудка, почечная недостаточность, хромота, воспаление перикарда, уменьшение подвижности суставов, предрасположенность к пневмонии. Причины этих симптомов неиз­вестны. Возможно, они связаны с долговремен­ным присутствием в организме избытка гормона роста. В этих экспериментах трансген синтези­ровался более или менее непрерывно. Были соз­даны также трансгенные овцы с повышенной скоростью роста шерсти. Для этого кДНК овечьего инсулиноподобного фактора роста I была помешена под контроль мышиного промо­тора гена кератина с высоким содержанием се­ры, что обеспечивало гиперэкспрссию кДНК. При этом у трансгенных овец в отличие от сви­ней никаких нежелательных побочных эффек­тов не наблюдалось.

Положительные результаты были получены и в ходе экспериментов с трансгенными свинья­ми. Например, были созданы здоровые транс­генные свиньи, в геноме которых присутствова­ла следующая генетическая конструкция: регуляторная область гена бета-глобина человека, два гена альфа 1- глобулина человека и один ген бета А - гло­бина человека. В результате ее экспрессии в клетках крови свиней синтезировался человеческий гемоглобин, при этом в результате замены человеческого промотора гена бета-глобина сви­ным человеческий гемоглобин синтезировался в значительно большем количестве. Человече­ский гемоглобин, продуцируемый трансгенны­ми свиньями, обладал такими же химическими свойствами, что и природный человеческий. Его можно было очистить от гемоглобина свиней обычной хроматографией.

Эти результаты указывают на принципиаль­ную возможность замены цельной крови, ис­пользуемой при трансфузии, человеческим ге­моглобином, полученным методом трансгеноза. Однако изолированный гемоглобин переносит кислород не так эффективно, как гемоглобин в составе эритроцитов. Более того, он быстро раз­рушается в организме животного, которому был введен, а продукты его распада токсичны для почек. Таким образом, получение заменителя человеческой крови с помощью трансгеноза — это дело далекого будущего.

В последнее время большое внимание уделя­ется вопросу об использовании органов живот­ных для трансплантации человеку. Основная проблема межвидовой трансплантации — это гиперострое отторжение. Гиперострое отторжение влечет за собой связывание антител организма-хозяина с углеводной антигенной детерминантой на поверхности клеток пересаженного орга­на. Связавшиеся антитела вызывают острую воспалительную реакцию (активацию каскада комплемента), происходит массовая гибель не­сущих антитела клеток и быстрая потеря переса­женного органа.

В естественных условиях воспалительная ре­акция блокируется особыми белками на поверх­ности клеток, выстилающих стенки кровенос­ных сосудов. Эти белки -   ингибиторы комплемента видоспецифичны. Было высказа­но предположение, что если бы животное-донор несло один или несколько генов человеческого белка, ингибирующего комплемент, то переса­женный орган был бы защищен от первичной воспалительной реакции. С этой целью были получены трансгенные свиньи, несущие различ­ные человеческие гены ингибитора комплемен­та. Клетки одного из этих животных оказались совершенно нечувствительными к компонентам системы каскада комплемента. Предварительные эксперименты по пересадке органов трансгенных свиней приматам показали, что ткани пересаженного органа повреждаются слабее, а сам орган не отторгается немного дольше. Воз­можно, трансгенные свиньи, несущие человече­ский ген ингибитора комплемента и лишенные основного поверхностного белка клеток свиней, который вызывает острейшее отторжение, будут служить источником органов для транспланта­ции человеку.

Обнадеживающей оказалась первая работа по получению трансгенных животных - продуцентов интерлейкина-2. Последний, являясь растворимым фактором Т-лимфоцитов хелперов, участвующих в пролиферации и дифференцировке Т-лимфоцитов киллеров, играет важную роль в обеспечении необходимого уровня иммунитета. С использованием генной конструкции, состоящей из ДНК бета-казеина кролика и структурного гена интерлейкина-2 человека, были получены кролики, секретирующие с молоком активную форму этого белка.                         

Таким образом, достигнута интеграция одного или нескольких генов в эмбрионы млекопитающих и доказана их экспрессия, а также передача потомству. Однако следует подчеркнуть трудности и неясности, с которыми по-прежнему связана техника получения трансгенных животных. Все еще слабо изучен механизм интеграции гена в клетки млекопитающего. Эта интеграция происходит случайным образом и не связана с конкретной областью хромосомы. Другая сложность обусловлена нестабильностью клеток, в которые вводится ген (гены): он может быть утрачен или модифицирован и в результате стать неактивным. Наконец, активность генов определяется не только последовательностями нуклеотидов, которые обеспечивают транскрипцию гена с образованием мРНК, но также другими последовательностями нуклеотидов, которые зачастую далеко стоят от собственного гена, и, если требуется достичь полной экспрессии гена, эти последовательности нужно вводить вместе с геном. Например, ген, ответственный за синтез альфа-глобулина, регулируется последовательностью ДНК, расположенной перед ним.

Достигнутые результаты генной инженерии в области получения трансгенных млекопитающих позволят углубить наши знания об экспрессии генов, что в перспективе облегчит перенос генов и определение факторов, способствующих более полному проявлению генетической информации, записанной в трансгенах. Кроме того, встраивание чужеродного гена в тот участок генома клетки, где в норме располагается гомологичный ген, возможно откроет путь для лечения генетических заболеваний, так как это позволит заменить дефектный или восполнить отсутствующий ген его активным аналогом.

Трансгенные птицы. Микроинъекция ДНК в оплодотворенные яйце­клетки птиц с целью получения трансгенных линий — непростая процедура. Это связано с не­которыми особенностями воспроизводства и развития птиц. Так, при оплодотворении у птиц в яйцеклетку могут проникнуть сразу несколько сперматозоидов, а не один, как это обычно бы­вает у млекопитающих, и идентифицировать тот мужской пронуклеус, который соединится с женским, становится невозможно. Метод мик­роинъекции ДНК в цитоплазму тоже не подхо­дит, поскольку в этом случае ДНК не интегри­руется в геном оплодотворенной яйцеклетки. Наконец, даже если удастся осуществить микро-инъекцию ДНК в ядро, дальнейшие операции будет трудно осуществить, поскольку у птиц яй­цеклетка после оплодотворения достаточно бы­стро обволакивается прочной мембраной, по­крывается слоем альбумина и внутренней и наружной известковыми оболочками.

Однако трансген можно вводить в область желтка (зародышевый диск), который содержит и женский, и мужской пронуклеусы и образует­ся раньше, чем скорлупа. После введения ДНК каждую яйцеклетку культивируют in vitro, и ко­гда образуется зародыш, его помешают в сурро­гатное яйцо, чтобы имитировать вылупление. При помощи такой стратегии была получена од­на линия трансгенных цыплят. Однако в насто­ящее время этот метод неэффективен и техниче­ски трудновыполним в обычных условиях.

К тому времени, когда наружная известковая оболочка яйцеклетки птиц затвердевает, заро­дыш, находящийся на стадии бластодермы, со­стоит из двух слоев по 40 000 и 80 000 клеток. Проведены эксперименты по инокуляции такого зародыша ретровирусными векторами с нару­шенной репликацией, несущими бактериальные маркерные гены. В результате были получены трансгенные цыплята и обыкновенные перепела, несущие чужеродные гены в клетках зародыше­вой линии. Обычно такие птицы не продуцируют свободных вирусных частиц и,  тем не менее, при­менение ретровирусных векторов в качестве «по­ставщиков» чужеродных генов животным, кото­рые затем могут использоваться в пищу, неизбежно вызывает вопросы относительно без­опасности такого подхода. Кроме того, размер трансгена, который может быть введен в орга­низм реципиента в составе ретровирусного век­тора, не превышает 8 т. п. н., а в некоторых слу­чаях интеграция в исходный сайт нестабильна. Все это заставило исследователей искать альтер­нативные способы трансгеноза.

Никаких специфичных для птиц ES-клеток не обнаружено, поэтому подход, основанный на их использовании, для птиц неприменим. Более перспективным представляется метод с исполь­зованием рекомбинантных эмбриональных кле­ток. Он состоит в следующем. Выделяют клетки бластодермы из куриного эмбриона, трансфицируют их с помощью катионных липидов (липосом), связанных с трансгенной ДНК (липосомная трансфекция), и повторно вводят в подзародышевую область свежеотложенных яиц. Часть потомков будет нести в каком-то неболь­шом количестве клетки донора: таких животных называют химерами. У некоторых химер клетки, произошедшие от трансфицированных клеток, могут образовывать линии зародышевых клеток, и после нескольких раундов скрещиваний таких химер можно получить линии трансгенных жи­вотных. Чтобы увеличить вероятность создания химер, несущих чужеродные гены в клетках за­родышевой линии, число донорских клеток в химерах можно увеличить облучением эмбрио­нов реципиента перед введением в них трансфи­цированных клеток. Под действием облучения некоторые (но не все) клетки бластодермы погибнут, и соотношение между трансфицированными клетками и клет­ками реципиента увеличится в пользу первых. По-видимому, таким образом можно получать трансгенных цыплят, хотя и с малой эффектив­ностью.

Трансгенных цыплят можно использовать для улучшения генотипа уже существующих по­род — для придания им (in vivo) устойчивости к вирусным инфекциям и заболеваниям, вызыва­емым кокцидиями, повышения эффективности усвоения пищи, снижения уровня жира и холестерола в яйцах, повышения качества мяса. Бы­ло предложено также использовать яйцо с его высоким содержанием белка в качестве источ­ника белковых продуктов, использующихся в фармацевтической промышленности. Экспрес­сия трансгена в клетках репродуктивного пути курицы, где обычно секретируется большое ко­личество овальбумина, может способствовать накоплению соответствующего белкового про­дукта в яйце, откуда его можно затем выделить.

Трансгенные рыбы. По мере истощения природных рыбных запасов все большую роль будет приобретать разведение рыбы в искусственных условиях. Основная цель исследований в этой области — создание реком­бинантных рыб путем трансгеноза. До настояще­го времени трансгены вводили микроинъекцией ДНК или электропорацией оплодотворенных яйцеклеток различных видов рыб — карпа, зу­батки, форели, лосося и т. д. Поскольку у рыб пронуклеус в оплодотворенной яйцеклетке пло­хо различим в обычный микроскоп, линеаризо­ванную трансгенную ДНК вводят в цитоплазму оплодотворенных яйцеклеток или клеток эмб­рионов, достигших стадии четырех бластомеров. Эмбриогенез у рыб протекает в водной среде вне организма, поэтому в имплантации нет необхо­димости. Все дальнейшие процессы могут про­текать в резервуарах с регулируемой температу­рой. Выживаемость эмбрионов рыб после микроинъекций довольно высока, от 35 до 80%, а доля трансгенных потомков колеблется от 10 до 70%. Трансген можно обнаружить с помо­щью ПЦР с использованием либо препаратов эритроцитов зародышей, либо суммарной ДНК. Скрещивая трансгенных рыб, можно вывести трансгенные линии.

Большинство первых исследований в этой области было направлено на исследование вли­яния трансгена гормона роста на скорость рос­та. В одном из экспериментов в яйцеклетки атлантического лосося был введен трансген, со­стоящий из следующих элементов: промотора гена антифризного белка американской бельдю­ги, кДНК гормона роста лосося, сигналов терминации/полиаденилирования 3'-конца гена антифризного белка американской бельдюги. Как правило, трансгенные лососи были крупнее и быстрее прибавляли в весе, чем контрольные нетрансформированные особи. В этом случае была выбрана система экспрессии с ускоренной транскрипцией гена гормона роста в холодной воде и пригодная для «всех рыб», что позволяло избежать биологической несовместимости, ко­торая могла бы возникнуть, если бы ген гормона роста происходил не из рыб. Годовалые трансгенные особи, полученные в результате введе­ния в яйцеклетки генетической конструк­ции гормона роста, подходящей для «всех лососей», весили примерно в 11 раз больше, чем нетрансгенные. Физиологическая активность линий таких трансгенных лососей в естествен­ных условиях вызывает значительный интерес. Предполагается, что в будущем гены устойчиво­сти к болезням и стрессовым воздействиям, а также гены, обуславливающие другие биологиче­ские особенности, будут введены как рыбам уме­ренных широт, так и тропическим рыбам.

Контрольные вопросы: Какие методы используются для введения чужеродной ДНК эмбрионам животных?; 2. Приведите примеры использования трансгенных животных для получения полезных продуктов; 3. Расскажите о достижениях генетической инженерии в селекции животных, устойчивых к различным заболеваниям; 4. Преимущества трансгенных животных перед микроорганизмами-продуцентами биопрепаратов; 5. Какие Вы знаете рекомбинантные белки, получаемые из молока сельскохозяйственных животных?; 6. Особенности методики создания трансгенных птиц и рыб.

Лекция №9