Поможем в ✍️ написании учебной работы

Имя

Поможем с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой

Выберите тип работыЧасть дипломаДипломная работаКурсовая работаКонтрольная работаРешение задачРефератНаучно - исследовательская работаОтчет по практикеОтветы на билетыТест/экзамен onlineМонографияЭссеДокладКомпьютерный набор текстаКомпьютерный чертежРецензияПереводРепетиторБизнес-планКонспектыПроверка качестваЭкзамен на сайтеАспирантский рефератМагистерская работаНаучная статьяНаучный трудТехническая редакция текстаЧертеж от рукиДиаграммы, таблицыПрезентация к защитеТезисный планРечь к дипломуДоработка заказа клиентаОтзыв на дипломПубликация статьи в ВАКПубликация статьи в ScopusДипломная работа MBAПовышение оригинальностиКопирайтингДругое

Нажимая кнопку "Продолжить", я принимаю политику конфиденциальности

МАТЕРИАЛЫ ЛЕКЦИЙ

ПО ДИСЦИПЛИНЕ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ БИОТЕХНОЛОГИИ В ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЕ И ЖИВОТНОВОДСТВЕ»

Лекция №1

Лекция №2

Лекция № 4

Биотехнология вакцин

В медицине и ветеринарии широко применяются разнообразные вакцины против инфекционных болезней человека и животных. К сожалению, ряд вакцин слабоиммуногенны, либо имеют побочные эффекты, либо требуют больших производственных расходов.

Рекомбинантные бактериальные вакцины. Иммуногенные свойства патогенных микроорганизмов чаще определяются конкретным белком или полисахаридной молекулой возбудителя, который кодируется одним-единственным геном. В настоящее время достижения генной инженерии дают исследователям возможность заставить прокариотную или эукариотную клетку синтезировать определенный антиген патогена, который будет служить основой для создания генно-инженерной вакцины.

 Принцип создания генноинженерных вакцин заключается в том, что в структуру ослабленных вирусов, бактерий, дрожжей или клеток высших организмов встраивается ген, который отвечает за образование антигена того возбудителя, против которого будет направлена вакцина. При этом отпадает необходимость в использовании убитых или ослабленных бактерий и вирусов, обеспечивается безопасность работников предприятий по производству вакцин, отсутствует токсичный или инфекционный материал, который часто загрязняет микробный антиген, полученный из клеточных культур, улучшается экологическая обстановка. Основным объектом приложения для генно-инженерных работ стали противовирусные вакцины, что объясняется простотой организации вирусных геномов. Более сложное строение бактериальных клеток и сравнительно низкая стоимость противобактериозных вакцин являются факторами, сдерживающими развитие генно-инженерных работ. В перспективе предполагается использовать векторы, в которые встроены не только гены, контролирующие синтез антигенов возбудителя, но и гены, кодирующие различные медиаторы (белки) иммунного ответа (интерфероны, интерлейкины и др.).

Первым среди возбудителей бактериальных инфекций человека внимание исследователей, занимающихся созданием генно-инженерных вакцин, привлек Treponema pallidum - возбудитель сифилиса. И это неслучайно. Во-первых, несмотря на то, что в распоряжении современной медицины имеются эффективные методы диагностики и терапии, сифилис приобрел эпидемическое распространение как в развитых, так и развивающихся странах; во-вторых, получение чистых культур бледной трепонемы представляет большие трудности, так как она не растет в искусственной среде; в-третьих, невозможно получить вакцину против него с помощью общепринятых методов, основанных на экстракции и очистке антигенов. Ловетт с коллегами (Университет шт. Калифорния) в 1982 году, используя бактериофаг в качестве вектора, ДНК этой спирохеты клонировали в клетках кишечной палочки. Генетический материал для эксперимента был выделен из яичек специально зараженных кроликов. Они получили штамм E.col i, который содержал не менее семи специфических антигенов трепонемы. Эти исследования имели своей целью разработку более специфичных тестов для диагностики сифилиса и производства эффективной вакцины (цит. по А.Сассон, 1987).

В ветеринарии первой генно-инженерной противобактерийной вакциной, нашедшей применение на практике, является вакцина против колибактериозов (эшерихиозов) поросят и телят, вызываемых патогенными штаммами E.coli. Разработчик этой вакцины - голландская ветеринарная фармацевтическая компания “Intervet international”. С целью выделения белка в количествах, достаточных для получения вакцины, они клонировали ген, ответственный за синтез адгезивных антигенов кишечной палочки К88 и К99, в штамме E. coli К-12. Эти антигены в комбинации с адъювантом были использованы для получения вакцины. Иммунизация коров и свиней этой вакциной вызывала образование защитных антител, которые затем передавались новорожденным с молозивом и молоком. Аналогичные вакцины были разработаны и компанией “Цетус” совместно с “Норден лэборатриз” (США) и “Тек Америка груп”.

Для конструирования живых генноинженерных (рекомбинантных) вакцин необходимы три составляющие их компонентов: бактериальный вектор - носитель гетерологических протективных антигенов, гены синтеза гетерологического антигена и генетические структуры, обеспечивающие стабильную и контролируемую экспрессию протективных антигенов, способных в свою очередь индуцировать эффективную защиту иммунизированного организма. 

В качестве бактериальных векторов находят применение сальмонеллы, эшерихии, микобактерии, бациллы, листерии, йерсинии, коринебактерии лактобактерии и франциселлы. При создании рекомбинантных вакцин для ветеринарной медицины наиболее приемлемыми на сегодня являются вакцинные штаммы S . typhimurium , S . choleraesuis , S . dublin , S . е nteritidis , S . а bortusovis , Mycobacterium bovis (шт.BCG), Bac . subtilis , Francisella tularensis (Э.А.Светоч и соавт., 2000). Большинство исследователей в качестве бактериального вектора используют генетически охарактеризованные штаммы сальмонелл, выдвигая в пользу этого следующие аргументы: сальмонеллы могут применяться как перорально, так и парентерально, стимулируя местный и системный иммунитет, включая выработку сывороточных антител и секреторных антител слизистых, клеточно- опосредованный иммунитет и антителозависимую цитотоксичность.

В ГНПЦПМ (Россия) активно разрабатываются проблемы по изучению возможности использования в качестве бактериальных векторов вакцинных штаммов Bac . anthracis. Это обусловлено в первую очередь следующими причинами: показана принципиальная возможность секреции чужеродных белков клетками вакцинного штамма сибиреязвенного микроба, неприхотливость бациллы к питательным средам и, наконец, высокая устойчивость спор Bac . anthracis , что обеспечит повышенную сохраняемость и стабильность конечных форм вакцинных препаратов.

К антигенам, обеспечивающим полноценную защиту, могут быть отнесены, например, антигены адгезии и термолабильный энтеротоксин патогенных эшерихий, О- и Vi -антигены сальмонелл, холерный и дифтерийный токсины, токсины возбудителей столбняка, ботулизма, газовой гангрены, злокачественного отека, капсульные антигены чумного микроба и др. Особенно актуальной для ветеринарии является разработка комбинированной вакцины против сибирской язвы и бруцеллеза (Шумилов К.В.). Получена генетическая конструкция, в которой функционируют ген летального токсина сибиреязвенного микроба и ген поверхностного белка Brucella abortus с мол. массой 31 кД (А.П Померанцев). В РосНИПЧИ «Микроб» были сконструированы генно-инженерные штаммы с клонированным геном pag, кодирующим синтез протективного антигена – основного иммуногена возбудителя сибирской язвы.

 Вакцины, содержащие лишь отдельные компоненты патогенного микроорганизма, называют и «субъединичными». Субъединичные вакцины имеют свои достоинства и недостатки. Достоинства состоят в том, что препарат, содержащий очищенный иммуногенный белок, стабилен и безопасен, его химические свойства известны, в нем отсутствуют дополнительные белки и нуклеиновые кислоты, которые могли бы вызывать нежелательные побочные эффекты в организме-хозяине. Недостатки заключаются в том, что очистка специфического белка стоит дорого, а конформация выделенного белка может отличаться от той, которую он имеет in situ (т. е. в составе вирусного капсида или оболочки), что может приводить к изменению его антигенных свойств. Решение о производстве субъединичной вакцины принимается с учетом всех имеющих отношение к делу биологических и экономических факторов.

В ветеринарной науке определенные успехи достигнуты в разработке субъединичной вакцины против ящура. Для защиты от этой инфекции используют вакцину, содержащую вирус, инактивированный формалином. В мире ежегодно производится примерно 1 млрд. доз этой вакцины.

Основной антигенной детерминантой, индуцирующей образование антител, является вирусный капсидный белок 1 (VP 1, viral protein 1). Это более слабый антиген, чем интактные вирусные частицы, но все же он индуцирует образование антител и обеспечивает защиту животных от инфекции. Поэтому были предприняты попытки клонировать VPl -ген.

Геном вируса ящура представляет собой одноцепочечную РНК. Поэтому сначала синтезировали полноразмерную двухцепочечную кДНК длиной примерно 8000 п. н. Затем ее расщепили с помощью рестрицируюших эндонуклеаз и клонировали полученные фрагменты в экспрессирующем E . coli-векторе. Продукт кодирующей последовательности VPl -гена идентифицировали иммунологическими методами как часть слитого (химерного) белка, синтез которого контролируется системой p^L-промотор—cl-peпpeccop. Белок состоит из 396 аминокислотных остатков, содержит часть молекулы репликазы бактериофага MS 2 и полноразмерный VP 1-белок вируса ящура, благодаря чему он и индуцирует выработку нейтрализующих вирус антител. Получить разрешение на применение вакцины, содержащей химерный белок, очень трудно, поэтому, вероятно, придется субклонировать VP 1-последовательность в другом экспрессирующем векторе. Так или иначе, субъединичная вакцина против ящура скоро будет готова для проведения доклинических испытаний.

В последнее время интенсивно изучаются белки теплового шока Mycobacterium tuberculosis как основа для субъединичной противотуберкулезной вакцины. С помощью ИФА и моноклональных антител к HSP65 определено наличие белков теплового шока  Mycobacterium tuberculosis в сыворотках крови у больных с подтвержденным туберкулезом и в сыворотках крови у пациентов с подозрением на туберкулез (И.А.Баснакьян и соавт, 2010). HSP65 Mycobacterium tuberculosis обнаруживали в цереброспинальной жидкости у больных туберкулезным менингитом, и наличие этого антигена может считаться диагностическим маркером туберкулезного менингита. Проведены исследования наличия сывороточных антител к HSP70 , HSP65 и  HSP 16 Mycobacterium tuberculosis  при туберкулезе и саркоидозе. При этом обнаружен значительно более высокий уровень указанных антител в сыворотках крови у пациентов с туберкулезом и саркоидозом, чем в сыворотках крови у здоровых людей. Таким образом, доказана важная роль белков теплового шока  в стимуляции иммунитета. О.А.Шараповой и соавт.(2009) были отработаны методы получения рекомбинантного белка теплового шока HSP70M Mycobacterium tuberculosis , изучены его параметры и проведен анализ HSP70M на соответствие требованиям доклинических испытаний. Шевчик Ю.С. и соавт.(2009) установлено, что рекомбинантный HSP70M Mycobacterium tuberculosis усиливает активацию врожденного и адаптивного иммунитета при совместном введении с бактериальными антигенами в эксперименте.

В попытках создания более безопасной и эффективной субъединичной противотуберкулезной вакцины были изучены иммуннопротективные свойства очищенных внеклеточных белков М. tuberculosis . Из жидкой бактериальной культуры были выделены и очищены шесть основных из 100 секретируемых белков, и каждый из них по отдельности, а затем различные их комбинации использовались для иммунизации морских свинок. Животным вводили в виде аэрозоля примерно 200 живых клеток М. tuberculosis , что является для них весьма высокой дозой. Через 9-10 нед животных умерщвляли и исследовали их легкие и селезенку на предмет присутствия этой патогенной бактерии. При введении некоторых комбинаций очищенных белков потеря веса, поражение легких и селезенки и уровень смертности были такими же, как и при иммунизации живой BCG-вакциной. Теперь нужно провести сравнение эффективности белков М. tuberculosis , полученных с помощью технологии рекомбинантных ДНК, с эффективностью секреторных белков и разработать безопасную и эффективную вакцину для профилактики туберкулеза у человека.

Синтетические пептидные вакцины. Далее возникает следующий вопрос: может ли небольшой участок белковой молекулы (домен) служить эффективной субъединичной вакциной и индуцировать выработку антител? Интуитивно кажется, что те домены, которые доступны для антитела (т. е. те, которые находятся на поверхности вируса), обладают иммуногенными свойствами, а внутренние домены несущественны, если только они не влияют на конформацию иммуногенного домена. Если это предположение верно, то короткие пептиды, имитирующие эпитопы (антигенные детерминанты), можно использовать для создания вакцин. Идея использования синтетических пептидов в качестве вакцин родилась при изучении клеточных и молекулярных механизмов развития иммунитета. В 1974 г. М.Села впервые описал искусственно полученный пептид, вызывающий образование антител к белку лизоцима. Синтезированы и испытаны полисахариды, аналогичные естественным антигенам, например, сальмонеллезным полисахаридам.

Техника рекомбинантных ДНК для получения вакцин открыла новые перспективы в разработке синтетических вакцин. Производство последних может заменить имеющиеся бактериальные и вирусные вакцины, часто содержащие посторонние антигенные детерминанты, белки и другие вещества, вызывающие побочные эффекты. Одиберт с сотр. (1981) использовали синтетический антиген дифтерийного токсина для активной иммунизации. Данный токсин представляет собой полипептидную цепь с молекулярной массой 62 кД и имеет две дисульфидные связи. Токсичность и иммуногенность белка обусловлены петлей на N-конце молекулы, состоящей из 14 аминокислот, удерживающихся дисульфидным мостиком. Синтетический пептид, связанный с двумя различными носителями, иницировал синтез антител, которые связывались с токсином и предотвращали его дермонекротическое и летальное действие. Формирования иммунитета удалось также добиться при инъекции синтетического пептида белка М Streptococcus pyogenes длиной всего 20 аминокислот. Такие иммуногенные олигопептиды могут составить основу безопасных вакцин против стрептококковых инфекций, которые вызывают ревматизм и связанные с ним поражения сердца.

Дрисман с коллегами (1982) синтезировали два пептида, аналогичные таковым на участке между 117-м и 137-м аминокислотными остатками полипептидной цепи поверхностного антигена вируса гепатита В (цит. по А.Сассон, 1987). Два пептида с последовательностями от 117-й до 137-й и от 122-й до 137-й аминокислоты вводили мышам внутрибрюшинно, используя различные адъюванты. В каждой группе у половины мышей через 7-14 дней после иммунизации были обнаружены антитела против поверхностного антигена вируса. Через три недели у большинства животных титры антител уменьшались.

В Исследовательском институте клиники Скриппса и Институте вирусологии животных (США) синтезированы полипептиды, соответствующие нескольким участкам белка VP1 вируса ящура. В дальнейших исследованиях они обнаружили, что один из полипептидов, включающий участок от 141-й до 160-й аминокислоты VP1, при инъекции с адъювантом и в комплексе с гемоцианином улитки (KLH) иницирует у морских свинок и кроликов синтез антител к вирусу. Причем, титры антител были в несколько раз выше, чем в случае иммунизации животных очищенным белком VP1. Эти животные проявляли устойчивость к последующему заражению (Bittle et al., 1982). Кроме того, преимущество синтетического пептида заключалось и в том, что однократное введение вызывало достаточный иммунный ответ. Данный пептид вызывал образование антител в количестве, достаточном для создания иммунитета у свиней и крупного рогатого скота против ящура. Создание вакцин против ящура на основе синтетических полипептидов могло бы устранить проблемы, возникающие в связи с недостаточной инактивацией вируса и нестабильностью инактивированных вакцин при рН ниже 7 и неблагоприятном температурном режиме внешней среды. Этот подход позволил бы использовать в качестве иммуногенов синтетические пептиды, соответствующие различным серотипам вируса.

Эти результаты являются весьма многообещающими, однако количество (доза) пептидного материала, необходимого для индукции иммунного ответа, примерно в 1000 раз выше, чем в случае убитой вакцины. Чтобы решить эту проблему, фрагмент ДНК, кодирующий пептид из аминокислотных остатков 142-160 VP 1, сшили с геном, кодирующим коровый белок гепатита В (HBcAg). При экспрессии этого химерного гена в Е. coli или культуре животных клеток его продукты — белковые молекулы - в процессе самосборки образовывали стабильные «27нм-частицы», на поверхности которых находился пептид из VP 1 вирса ящура. Эти частицы обладали высокой иммуногенностью. Таким образом, HBcAg можно использовать в качестве эффективной молекулы-носителя синтетических пептидов. Сравнение иммуногенности различных пептидных вакцин, содержащих домен 142-160 VP 1-белка, проведенное на морских свинках, показало, что иммуногенность химерного белка, состоящего из HBcAg и указанного домена, в 10 раз ниже, чем у инактивированных вирусов, в 35 раз выше, чем у химерного белка, содержащего b-галактозидазу Е. coli и домен 137-162 из VP 1 вируса ящура, и в 500 раз выше, чем у свободного синтетического пептида, состоящего из аминокислотных остатков 142-160. Поскольку синтетический пептид, сшитый с HBcAg, образует 27нм-частицы, сходные с вирусом гепатита В, и они обладают почти такой же иммуногенностью, как и интактный вирус, на основе которого получен синтетический пептид, этот подход может стать основным способом доставки пептидных вакцин к месту их действия.

И все же существует несколько ограничений на использование коротких пептидов в качестве вакцин: эпитоп, использующийся для создания эффективной пептидной вакцины, должен представлять собой короткий, но непрерывный участок белковой молекулы, а это бывает не всегда; конформация пептида должна быть такой же, как у эпитопа в интактной вирусной частице; изолированный эпитоп может не обладать достаточной иммуногенностью. В будущем синтетические пептидные вакцины могут стать высокоспецифичной, относительно недорогой, безопасной и эффективной альтернативой традиционным вакцинам, хотя для этого необходимо провести еще немало исследований.

В процессе разработки находятся и другие антигены, нацеленные на создание иммунитета против вирусных инфекций. Например, антиидиотипические антитела, получаемые в ответ на иммунизацию противовирусными антителами (Lerner et al., 1985; Dreesman et al., 1985). Антитела, синтезированные против антител, способных узнавать определенные антигенные эпитопы, в свою очередь, сохраняют особенности структуры данных детерминант. Как известно, антиген и антитело соответствуют друг другу как ключ замку. Другими словами, активный центр антитела является как бы слепком детерминанты иммунизирующего антигена. В результате последовательных иммунизаций исходным антигеном, а затем и антителами первого и второго поколений можно получить антитела третьего поколения, по существу повторяющие исходные антитела первого поколения, полученные при иммунизации непосредственно вирусным антигеном. Возможность использования моноклональных антител для получения антиидиотипических антител с “образом” определенных антигенов открывает новые перспективы в конструировании вакцин нового типа. Это особенно важно в борьбе с вирусными инфекциями, возбудителей которых трудно получить в достаточном количестве для разработки вакцин, а также при работе с антигенными эпитопами конформационной природы, для которых невозможно или сложно создавать химические или генно-инженерные вакцины. 

Антиидиотипические вакцины обладают рядом преимуществ перед традиционными профилактическими препаратами. В первую очередь иммуноглобулиновая природа АИАТ исключает возможность реверсии живого аттенуированного микроорганизма в вирулентную форму. Имитация CDR-областью (Comp lementarity determining region- область, определяющая комплементарность) АИАТ конкретного протективного эпитопа антигена обеспечивает направленную индукцию защитных антител макроорганизма, устраняя синтез антител против слабоиммуногенных и неиммуногенных детерминант микроба или компонентов химических вакцин, что значительно влияет на эффективность иммунизации. Кроме того, как известно, синтетические пептиды, соответствующие участкам первичной аминокислотной последовательности, созданные путем химического синтеза или молекулярного клонирования, не всегда способны поддерживать нативную трехмерную структуру, необходимую для индукции антител нужной специфичности и иммуногенности, что было подтверждено и на модели возбудителя чумы, в отличие от АИАТ, отбираемых именно по конформационной специфичности как «зеркальное отражающих» форму антигенного эпитопа.   

Перспективы создания экспериментальных антиидиотипических вакцин против чумы изучались Федоровым В.А. и Девдариани (2006). Ими получены мышиные АИАТ к белкам Y.pestis c мол. Массой 72, 54, 25 и 87 кД, кодируемым плазмидой вирулентности возбудителя чумы. Для этого мышей линии BALB/с иммунизировали по оригинальной схеме МКА к каждому из антигенов. Комплементарность исходным антигенам была подтверждена с использованием иммунохимического, функционального, иммунологического и иммунобиологического критериев оценки природы «внутреннего образа» соответствующих антител. Все АИАТ реагировали с ксеногенными (кролики, лошади, морские свинки и мыши) сыворотками к исходным антигенам, индуцировали высокий уровень специфических антител с серологическими свойствами, идентичными идиотипическим МКА, демонстрировали выраженную адъювантную активность и были классифицированы как принадлежащие к субтипу АТ2-бета. Наиболее важным свойством АИАТ была способность защищать от экспериментальной чумы не менее 77-80% мышей. Авторы полагают, что АИАТ являются перспективными компонентами при конструировании профилактических препаратов против чумы. Одним из существенных преимуществ антиидиотипических вакцин перед, например, аттенуированными или рекомбинантными живыми вакцинами является возможность их экстренного однонаправленного применения с антибактериальными препаратами при чрезвычайных ситуациях природного, техногенного или биотеррористического характера.          

ДНК-вакцины. Новый подход, позволяющий индуцировать у организма иммунный ответ без введения антигена, основан на включении в клетки животного-мишени гена, кодирующего белок-антиген. В первых экспериментах такого рода Е. coli-плазмиду, содержащую клонированный ген белка-антигена, транскрипция которого находилась под контролем промотора вируса животных, конъюгировали с микрочастицами золота и бомбардировали ими клетки уха мыши. Впоследствии выяснилось, что клонированную кДНК можно вводить в клетки и с помощью внутримышечной инъекции раствора с большим количеством плазмиды, несущей соответствующую ДНК. Для этого необходимо в 10³-10⁴ раз больше ДНК, чем при бомбардировке микрочастицами. В одном из экспериментов более чем в 75% случаев ген включался в клетки мыши, и синтезированный белок-антиген индуцировал синтез антител. Этот подход позволяет избежать очистки антигена, что требует много времени и средств, или использования для создания вакцины технологии рекомбинантных ДНК. Кроме того, получаемые с его помощью белки с большей вероятностью подвергаются правильной посттрансляционной модификации, чем белки, синтезируемые организмами-хозяевами. Этот метод, получивший название генной иммунизации, можно использовать для вакцинации домашних животных. 

Плазмидная ДНК представляет собой кольцевую ковалентно-замкнутую молекулу длиной 4-6 тысяч пар нуклеотидов. В ней имеется участок, ответственный за начало транскрипции (промотор), ген протективного белка, ген, обеспечивающий устойчивость клеток к антибиотику (ампициллину), и участок репликации плазмидной ДНК. Репликация плазмидной ДНК происходит только в бактериальных клетках, тогда как транскрипция гена протективного белка осуществляется только в клетках млекопитающих. Плазмидную ДНК реплицируют в клетках кишечной палочки в присутствии ампициллина, очищают и вводят внутримышечно животным в дозе 10 –12 млрд. молекул. Плазмидная ДНК поглощается клетками животных в небольшом количестве (0,01-1,0%), а большая часть ее быстро разрушается. Проникшая в клетку ДНК транспортируется в ядро и транскрибируется клеточной ДНК-зависимой РНК-полимеразой 2 с образованием информационной РНК, которая в цитоплазме обеспечивает синтез протективного белка. Плазмидная ДНК длительное время (до 3-6 мес.) функционирует в клетках. В организме животного плазмидная ДНК не размножается, не встраивается в хромосомы, и на нее не образуются антитела. Синтезированный в клетках протективный белок расщепляется в цитоплазматических протеосомах на короткие пептиды (8-10 аминокислот). Последние связываются с молекулами главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) класса 1 и транспортируются к клеточной поверхности. Синтезированный протективный белок может транспортироваться из клетки в межклеточное пространство в свободном нерасщепленном состоянии. Он связывается с антигенпрезентирующими клетками (макрофагами), проникает в них путем эндоцитоза и расщепляется в эндосомах на короткие фрагменты (10-20 аминокислот). Фрагменты белка объединяются с молекулами ГКГС класса 2 и встраиваются в поверхностную мембрану клетки. На поверхности клетки комплексы антиген +молекулы ГКГС 2 распознаются Т-хелперами. В-лимфоциты под воздействием протективного белка и антигенспецифических активированных Т-хелперов превращаются в антителопродуцирующие клетки.

Перспективы генной иммунизации были тщательно изучены. В одной из серий экспериментов мышам в квадрицепсы обеих задних конечностей вводили раствор с Е. со li -плазмидой, несущей кДНК нуклеопротеина вируса гриппа А, транскрипция которой находилась под контролем промотора вируса саркомы Рауса или цитомегаловируса. Хотя уровень экспрессии гена нуклеопротеина был настолько низок, что не поддавался регистрации, через 2 нед. после иммунизации в крови мышей обнаруживались антитела к нему. Выживаемость иммунизированных мышей оказалась значительно выше, чем мышей из контрольной группы. Более того, они были нечувствительны и к другому штамму вируса гриппа. Такая перекрестная защита не вырабатывается при введении традиционных противогриппозных вакцин, полученных на основе поверхностных антигенов вируса, и поэтому каждая вакцина специфична лишь к одному штамму вируса. Более того, традиционные вакцины сохраняют свою эффективность только до тех пор, пока остаются неизмененными поверхностные антигены. К сожалению, для генов поверхностных антигенов характерна высокая частота мутаций, что приводит к появлению существенно различающихся штаммов вируса. Коровые же белки, такие как нуклепротеин, относительно стабильны и активируют иммунную систему по другому механизму, чем поверхностные антигены.

ДНК-иммунизация позволяет не только избежать очистки белковых антигенов, но и индуцировать иммунный ответ, направленный именно на кодируемый плазмидой белок, а не на саму плазмиду. Поэтому один и тот же вектор можно использовать для доставки разных белков или для многократного введения одного и того же гена.

Судьба введенной в клетку ДНК точно неизвестна. В принципе она может интегрировать в геном хозяина с весьма серьезными последствиями, если при этом затрагивается какой-то важный ген или происходит злокачественная трансформация клетки. Однако такое развитие событий считается крайне маловероятным. Скорее всего такая ДНК какое-то время просуществует в клетке в виде нереплицируюшегося внехромосомного элемента, а затем разрушится. Генную иммунизацию пока используют для выработки иммунитета к некоторым патогенным микроорганизмам (вирусу гриппа А, вирусу иммунодефицита человека типа I, вирусу бычьего герпеса, вирусу бешенства, Plasmodium sp., вызывающему малярию, вирусу гепатита В у животных (но не у человека), а также возбудителям микоплазмоза, туберкулеза и сальмонеллеза. В опытах на лабораторных животных показана возможность применения ДНК-вакцинации для защиты от СПИДа и др. Появляются и работы по использованию ДНК-вакцин и в ветеринарии. P . J . Lewis (1997) показали возможность использования векторных плазмид для иммунизации против вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, а W . Jiang (1998) – эффективность ДНК-вакцинации при парвовирусной инфекции собак. Протективный иммунитет наблюдали у животных, вакцинированных плазмидой, кодирующей гликопротеин С вируса болезни Ауески (V . Gerdts et al ., 1997). Получены результаты по ДНК-вакцинации против вирусной диареи телят ( S . Harpin et al., 1997). Плазмида, кодирующая Hbs-антиген вируса гепатита уток В защищала их от инфекции при заражении (M . Triyatni et al., 1998). 

Для облегчения доставки ДНК в клетки животных при проведении генной иммунизации был создан модифицированный штамм Shigella flexneri . Эта бактерия проникает в эпителиальные клетки животных путем фагоцитоза, и присутствующая в ней плазмидная ДНК попадает в цитоплазму клетки-хозяина, где и происходят транскрипция и трансляция переносимого ею гена, находящегося под контролем эукариотического промотора. Shigella — это патогенный микроорганизм, и как таковой он не может использоваться для доставки ДНК. Ее непатогенный штамм можно получить, введя делецию в ген asd , кодирующий фермент аспартат-b-полу-альдегид—дегидрогеназу, который участвует в синтезе компонента клеточной стенки диаминопимелиновой кислоты. Штаммы с мутацией в asd -гене растут только в присутствии диаминопимелиновой кислоты и их можно использовать для доставки плазмидной ДНК в эпителиальные клетки животных, поскольку они в них не пролиферируют.

Эксперименты, в которых в качестве вектора для доставки ДНК в клетки использовались Shigella, были проведены на морских свинках, и хотя они оказались успешными, судить о безопасности данной системы можно будет лишь после проведения клинических испытаний. Огромным преимуществом этого подхода является возможность перорального введения. 

В настоящее время актуальным направлением в разработке генноинженерных вакцин является конструирование различных ДНК-вакцин на базе одного плазмидного вектора. При этом меняют только ген, кодирующий протективный белок. Следует отметить, что ДНК-вакцины обладают безопасностью инактивированных вакцин и эффективностью живых. В одну плазмидную ДНК можно встраивать гены протективных белков нескольких возбудителей и гены цитокинов – регуляторов иммунного ответа. Проходят экспериментальное изучение ДНК-вакцины, изготовленные из вирусов иммунодефицита человека, гриппа, бешенства, гепатита В и С, простого герпеса, папилломы, а также возбудителей туберкулеза и паразитарных заболеваний (малярий и лейшманиоза). Эффективность иммунизации ДНК-вакцинами очевидна, однако потребуется еще много усилий для практической реализации нового подхода к профилактике инфекционных болезней животных. Однако остаются не решенными проблемы безопасности для человека вакцин из плазмидной ДНК. Не определена степень риска мутагенных эффектов и иммунопатологических реакций в ответ на введение ДНК-вакцины. Отсутствуют четкие представления о побочных действиях образовавшихся антигенов и медиаторов иммунного ответа.

 «Векторные» вакцины. В качестве эффективной живой противооспенной вакцины широко используют вирус коровьей оспы (ВКО), относящийся к роду поксвирусов. Геном этого вируса полностью секвенирован; он представляет собой двухцепочечную ДНК длиной 187т.п.н., кодирующую примерно 200 разных белков. ДНК ВКО реплицируется в цитоплазме инфицированных клеток, а не в ядре, благодаря наличию у вируса генов ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы и ферментов, осуществляющих кэпирование, метилирование и полиаденилирование мРНК. Поэтому, если в геном ВКО встроить чужеродный ген, так чтобы он находился под контролем ВКО-промотора, то он будет экспрессироваться независимо от регуляторных и ферментных систем хозяина.

ВКО имеет широкий спектр хозяев (позвоночных и беспозвоночных), остается жизнеспособным в течение многих лет после лиофилизации (испарения воды с помощью замораживания) и не обладает онкогенными свойствами, а потому может использоваться для создания так называемых векторных вакцин. С их помощью осуществляется доставка и экспрессия в организме-хозяине клонированных генов, кодирующих антигенные белки, которые индуцируют выработку протективных антител. Геном ВКО имеет большие размеры и не содержит уникальных сайтов рестрикции, что не позволяет встраивать в него дополнительные нуклеотидные последовательности. Однако нужные гены можно вводить в геном ВКО с помощью гомологичной рекомбинации in vivo следующим образом.     

Сегмент ДНК, кодирующий специфичный антиген (например, HBcAg), встраивают в плазмидный вектор непосредственно после клонированного ВКО-промотора, включенного в какой-либо несущественный ген ВКО, например ген тимидинкиназы. Далее, этой плазмидой трансформируют культуру дефектных по тимидинкиназе животных клеток, обычно фибробластов куриного эмбриона, предварительно инфицированных ВКО дикого типа, который синтезирует функциональную тимидинкиназу. В результате рекомбинации между нуклеотидными последовательностями, фланкирующими промотор и ген протективного антигена, и гомологичными последовательностями вирусного генома происходит встраивание клонированного гена в вирусную ДНК. Частота таких рекомбинаций невысока, однако популяцию клеток, содержащих рекомбинантный ВКО, можно обогатить, используя селективную среду с бромдезоксиуридином. Этот токсичный аналог тимидина в отсутствие тимидинкиназы не включается в синтезируемую ДНК и не оказывает токсического действия. Дефектные по тимидинкиназе клетки-хозяева, которые содержат обычный ВКО, в присутствии бромдезоксиуридина погибают, а клетки, несущие рекомбинантный ВКО с разрывом в гене тимидинкиназы, становятся устойчивыми к его токсическому действию. И, наконец, проводят окончательный отбор с помощью ДНК-зонда, гибридизующегося с геном антигенного белка.

Поскольку дефектные по тимидинкиназе ВКО спонтанно возникают с относительно высокой частотой (примерно 1 на 10³—10⁴ вирусных частиц), нередко проводят котрансфекцию клеток каким-либо селективным маркером и нужным геном. Это облегчает разграничение спонтанных мутантов и мутантов, полученных с помощью гомологичной рекомбинации. В качестве селективного маркера обычно используют ген пео, кодирующий фермент неомицин-фосфотрансферазу II и обеспечивающий устойчивость к аналогу канамицина G -418. Этот ген, в отличие от других селективных маркеров, остается стабильным при встраивании в геном ВКО.

Разработана специальная система, позволяющая избежать прерывания рамки считывания генов ВКО при встраивании чужеродного гена. При этом отпадает необходимость в использовании селективных маркеров, поскольку каждый образующий бляшку рекомбинантный вирус будет содержать и экспрессировать ген-мишень. ДНК ВКО дикого типа несет ген vp 37, отвечающий за образование бляшек при росте вируса в монослойной культуре животных клеток. Если заменить этот ген маркерным геном Е. coli , то образуется мутантный ВКО, который не формирует бляшки при выращивании его в течение 2—3 сут в культуре животных клеток. Ген-мишень вводят в этот мутантный вирус с помощью гомологичной рекомбинации его ДНК с вектором, несущим ген vp 37 и ген-мишень. Мутантный ВКО, получивший ген vp 37, приобретает способность к образованию бляшек, при этом в его геном встраивается ген-мишень, а маркерный ген утрачивается. Мутантный вирус с делегированным геном vp37 не может реверсировать к дикому типу, поэтому каждая вирусная частица, образующая бляшку, содержит желаемую конструкцию. Этот метод прост, применим для переноса и экспрессии любого гена-мишени, не требует каких-либо дополнительных маркерных генов и не прерывает рамку считывания генов ВКО.

В геном ВКО уже удалось встроить и экспрессировать в культуре животных клеток несколько генов антигенных белков: G-белка вируса бешенства, поверхностного антигена гепатита В, поверхностных белков вируса Синдбис, NP - и НА-белков вируса гриппа, N- и G-белков вируса везикулярного стоматита, гликопротеинов вируса простого герпеса. Некоторые из полученных на основе ВКО рекомбинантных векторов можно использовать для создания эффективных вакцин. Так, рекомбинантный ВКО, экспрессирующий ген гликопротеина D вируса простого герпеса типа 1, предотвращает герпесные инфекции у мышей, а рекомбинантный ВКО, экспрессирующий ген поверхностного антигена вируса бешенства, индуцирует выработку протективных антител у лис, основных переносчиков вируса бешенства в Европе.

Векторные ВКО-вакцины позволяют провести иммунизацию сразу от нескольких заболеваний. Для этого можно использовать рекомбинантный ВКО, который несет несколько генов, кодирующих разные антигены.

В зависимости от используемого ВКО-промотора чужеродный белок может синтезироваться в ранней или поздней фазе инфекционного цикла, при этом его количество определяется силой промотора. Обычно для достижения высокого уровня экспрессии используют «поздние» ВКО-промоторы: pll (промотор гена, отвечающего за синтез белка мол. массой 11 кДа) или рСАЕ (промотор гена интегрального белка вируса коровьей оспы типа А). При встраивании в одну ДНК ВКО нескольких чужеродных генов каждый из них помещают под контроль отдельного ВКО-промотора, чтобы предотвратить гомологичную рекомбинацию между различными участками вирусной ДНК, которая может привести к утрате встроенных генов.

Живая рекомбинантная вирусная вакцина имеет ряд преимуществ перед неживыми вирусными и субъединичными вакцинами: 1) презентация аутентичного антигена практически не отличается от таковой при обычной инфекции; 2) вирус может реплицироваться в клетке-хозяине и увеличивать количество антигена, который активирует продукцию антител В-лимфоцитами (гуморальный иммунитет) и стимулирует выработку Т-клеток (клеточный иммунитет); 3) встраивание генов антигенных белков в один и большее число сайтов генома ВКО еще больше уменьшает его вирулентность.

Недостаток живой рекомбинантной вирусной вакцины состоит в том, что при вакцинации лиц со сниженным иммунным статусом (например, больных СПИДом) у них может развиться тяжелая вирусная инфекция. Чтобы решить эту проблему, можно встроить в вирусный вектор ген, кодирующий человеческий интерлейкин-2, который стимулирует Т-клеточный ответ и ограничивает пролиферацию вируса.

Нежелательные побочные эффекты пролиферации ВКО можно предупредить инактивацией вируса после вакцинации. Для этого был создан чувствительный к интерферону вирус (ВКО дикого типа относительно устойчив к его действию), пролиферацию которого можно регулировать в случае возникших при вакцинации осложнений.

Механизм устойчивости ВКО к интерферону оставался неустановленным, пока не была обнаружена открытая рамка считывания K 3 L, кодирующая белок мол. массой 10,5 кДа. Этот белок содержит аминокислотную последовательность, гомологичную N-концевой части эукариотического фактора инициации elF -2 a мол. массой 36,1 кДа. N-концевые области обоих белков содержат 87 практически идентичных аминокислотных остатков, причем в положении 51 в обоих случаях находится серин, который в elF-2 a фосфорилируется активируемой интерфероном Р1-киназой, что приводит к ингибированию синтеза белка в обработанных интерфероном клетках. K 3 L-белок действует как конкурентный ингибитор фосфорилирования elF -2альфа, обеспечивая устойчивость ВКО к интерферону, и если из генома ВКО удалить ген K 3 L или его часть, то вирус станет чувствительным к интерферону. С помощью ПЦР-мутагенеза гена K 3 L , находящегося в составе плазмиды, и последующей гомологичной рекомбинации между ДНК ВКО и плазмидой с целью замены К3L-последовательности дикого типа модифицированным вариантом был сконструирован мутантный ВКО K 3 L ^- . Этот штамм оказался в 10—15 раз более чувствительным к интерферону, чем штамм дикого типа. Эта работа является важным этапом на пути создания более безопасных ВКО-векторов. Последовательности, сходные с K 3 L, могут содержать и другие устойчивые к интерферону вирусы, что позволит с помощью делеций создавать их штаммы, чувствительные к интерферону.

Большинство работ по созданию живых вирусных вакцин проводились на ВКО, однако в качестве кандидатов на роль векторов для вакцинации рассматриваются и другие вирусы: аденовирус, полиовирус и вирус ветряной оспы. Вектор на основе живого аттенуированного полиовируса привлекателен тем, что позволяет проводить пероральную вакцинацию. Такие «слизистые» вакцины (вакцины, компоненты которых связываются с рецепторами, расположенными в легких или желудочно-кишечном тракте) пригодны для профилактики самых разных заболеваний: холеры, брюшного тифа, гриппа, пневмонии, мононуклеоза, бешенства, СПИДа, болезни Лайма. Но до любых клинических испытаний любого на первый взгляд безобидного вируса, как системы доставки и экспрессии соответствующего гена, необходимо убедиться в том, что он действительно безопасен. Например, повсеместно используемый ВКО вызывает у людей осложнения с частотой примерно 3,0-10^-6. Поэтому из генома рекомбинантного вируса, который предполагается использовать для вакцинации человека, желательно удалить последовательности, ответственные за вирулентность.

Бактерии как системы доставки антигенов. Антигены, находящиеся на наружной поверхности бактериальной клетки, обладают более высокой иммуногенностью, чем локализованные в цитоплазме. Поэтому один из подходов, используемых при создании вакцин, состоит в размещении протективного антигена патогенной бактерии на поверхности живой непатогенной бактерии. Многие бактерии имеют жгутики, состоящие из белка флагеллина; под микроскопом они выглядят как нити, отходящие от бактериальной клетки. Если сделать так, что жгутики непатогенного микроорганизма будут нести специфический эпитоп патогенного микроорганизма, то можно будет индуцировать выработку протективных антител.

Именно такой подход использовали при создании противохолерной вакцины. Синтетический олигонуклеотид, кодирующий эпитоп субъединицы В холерного токсина, встроили в гипервариабельный участок гена флагеллина Salmonella и полученную конструкцию ввели в дефектный по флагеллину штамм Salmonella . При этом было известно, что эпитоп, включающий 50—64 аминокислотные остатки субъединицы В холерного токсина, индуцирует выработку антител к интактному холерному токсину. Химерный флагеллин нормально функционировал, а эпитоп холерного токсина размещался на поверхности жгутиков. Иммунизация мышей с помощью интраперитонеальной инъекции примерно 5-10⁶ живых или убитых формалином бактерий с модифицированным флагеллином индуцировала выработку большого количества антител как к пептиду (50—64 аминокислотным остаткам), так и к молекуле интактного холерного токсина. Аналогичным образом можно встраивать два и даже три разных эпитопа в один флагеллиновый ген Salmonella и создать поливалентную противобактериальную вакцину.

С помощью перорального введения аттенуированных штаммов Salmonella можно осуществлять доставку в организм хозяина многих бактериальных, вирусных и паразитарных антигенов. Большую роль при этом играет выбор промотора, контролирующего транскрипцию чужеродного гена. Если используется слишком сильный промотор, может возникнуть метаболическая «перегрузка», сдерживающая пролиферацию бактерий. В отличие от ферментера, организм животного-хозяина не является замкнутой системой и экспрессию чужеродного гена нельзя регулировать изменением температуры или добавлением специфических метаболитов. Регуляторную роль может играть только промотор, реагирующий на те или иные сигналы. Например, работу промотора nirB E . coli можно регулировать, изменяя содержание нитритов и кислорода в среде, а наиболее активен он в анаэробных условиях. В одном из экспериментов промотор nirB использовали для контроля экспрессии гена нетоксичного иммуногенного С-фрагмента столбнячного токсина в аттенуированном штамме Salmonella . В развивающихся странах инфекция Clostridium tetani уносит более 1 млн. жизней в год. Если генетически модифицированный штамм Salmonella выращивать в аэробных условиях, то С-фрагмент столбнячного токсина синтезироваться не будет. При пероральном же введении этой бактерии тестируемым мышам С-фрагмент синтезируется, и у животных вырабатываются антитела к нему. Таким образом, штамм Salmonella , в который встроен С-фрагмент столбнячного токсина, находящийся под контролем промотора nirB , можно использовать как живую пероральную противостолбнячную вакцину. Чтобы выяснить, насколько эффективен этот подход при вакцинации человека, необходимо провести дополнительные исследования.

Съедобные вакцины. Успехи в области генетической инженерии открыли новые возможности для получения рекомбинантных белков. Для этой цели широко используются клетки бактерий, дрожжей, млекопитающих и насекомых. Однако они имеют ряд существенных недостатков. В клетках прокариот не происходит посттрансляционная модификация и правильная укладка полипептидных цепей многих эукариотных белков. Клетки млекопитающих и насекомых лишены подобных недостатков, однако использование в качестве биопродуцентов ограничено высокой себестоимостью выхода рекомбинантных белков. По сравнению с вышеупомянутыми системами экспрессии растения имеют ряд особенностей и преимуществ. Прежде всего необходимо отметить, что в высших растениях происходит гликозилирование и фолдинг белков, сходные таковым в клетках млекопитающих. Культивирование растений не требует дорогостоящего оборудования, в отличие от животных, растительные клетки не содержат в составе патогенные для человека вирусы, а также прионы и, таким образом, служат безопасным источником рекомбинантных белков. В дополнение ко всему перенос фрагментов экзогенной ДНК в растительный геном и регенерация у растений происходит значительно проще по сравнению с животными.

Революционным направлением в современной вакцинологии является разработка вакцин на основе трансгенных растений, в геном которых был встроен соответствующий фрагмент генома патогенного микроорганизма. Трансгенные растения-продуценты эпитопов болезнетворных агентов получили название «съедобных вакцин». Механизм иммунизации вакцинами основан на антигенпредставляющей способности перитонеальных макрофагов тонкого кишечника млекопитающих. Секреторные иммуноглобулины IgM транспортируются на поверхность слизистой оболочки, где они связываются с чужеродными агентами и препятствуют проникновению их в организм. Следует отметить, что мукозная вакцина стимулирует как иммунный ответ слизистых оболочек - первого защитного барьера на пути патогенных объектов, так и общий иммунный ответ организма. Первая такая вакцина была получена в 1992 год: трансгенное растение табака стало продуцировать «австралийский» антиген. Полученный из растений и частично очищенный антиген, введенный мышам, вызывал мощный иммунный ответ подобно вакцине против гепатита В. В 1998 году с помощью картофеля, продуцирующего В-субъединицу холерного анатоксина, была получена выраженная защита у поедавших его мышей при заражении их холерой. В том же году 10 из 11 добровольцев, получивших по 100 г сырого картофеля, продуцирующего антигены энтеропатогенной кишечной палочки, начали вырабатывать в слизистой кишечника антитела к этому возбудителю. Сейчас испытываются «картофельные» вакцины к возбудителю диареи и гепатита В с обнадеживающими результатами. На животных испытываются вакцины против бешенства, ящура. Исследования проводятся на основе трансгенных растений картофеля, салата, кукурузы, шпината, люцерны и др. Получен иммуногенный мембранный белок Brucella abortus Omp 16 в растительных клетках табака (А.А.Чистякова, 2010). С учетом необходимости использования эти «вакцинные продукты» в сыром виде, ведутся исследования по выращиванию вакцин на растениях, которые не требуют приготовления, например, на бананах, на моркови. А.А.Какимжановой и соавт.(2011) получены полноценные трансгенные растения моркови, несущие гены антигенов возбудителя туберкулеза M . tuberculosis esat 6 и cfr 10. Проведен полный цикл выращивания трансгенных растений от индукции соматических зародышей из трансформированных клеток, устойчивых к антибиотику канамицину в условиях in vitro , до получения полноценных растений, способных к формированию корнеплодов.  На сегодняшний день получены трансгенные растения-продуценты различных типов антител к эпитопам ряда антигенов (стафилококки, стрептококки, вирус простого герпеса, раковый эмбриональный антиген). Трансгенные растения рассматриваются и как потенциальный недорогой источник иммуноглобулинов человека и животных.  

Контрольные вопросы: 1. Принципы создания генноинженерных вакцин; 2. Какие микроорганизмы находят применение в качестве бактериальных векторов при создании рекомбинантных вакцин? 3. Какие вакцины называют субъединичными, синтетическими, векторными и ДНК-?

 

Лекция №5

Лекция №6

Лекция №7

Лекция №8

Проблемы генной инженерии в создании трансгенных животны х

Для выведения улучшенных пород домашних животных и птиц (коров с более высокой удой­ностью, овец с качественной шерстью, кур с более высокой яйценоскостью и т. д.) проводят множество раундов скрещиваний и отбора, ка­ждый раз используя в качестве производителей животных с наилучшими характеристиками. В результате со временем можно получать более или менее чистые линии высокопродуктивных пород животных. Стратегия скрещивания и от­бора, требующая больших временных и матери­альных затрат, оказалась тем не менее исклю­чительно успешной, и сегодня почти все аспекты биологических основ выведения но­вых пород домашнего скота могут быть к ней сведены. Однако после того как эффективная генетическая линия получена, вводить новые признаки методом скрещивания и отбора ста­новится все труднее. Так, линия с новым «цен­ным» геном может нести также и «вредные» ге­ны, вследствие чего потомки могут оказаться менее продуктивными. Чтобы быть уверенны­ми в том, что новая, улучшенная линия сохра­нит исходные полезные признаки и приобретет новые, необходимо разработать абсолютно но­вую стратегию. 

 Для создания трансгенных линий животных решающее значение в животноводстве имеет получение таких особей, у которых все или часть половых клеток имеют трансген. Исследования родившихся трансгенных животных и полученного от них потомства показали, что, несмотря на введение ДНК на ранних стадиях (в пронуклеус оплодотворенного ооцита), могут появляться мозаики. Мозаики - это животные, состоящие из двух или нескольких клеточных линий, происходящих из одной зиготы, но имеющие различные генотипы. Такие животные, кроме клеточных линий с трансгеном, имеют нетрансгенные клеточные линии. Поэтому, если половые клетки не содержат трансген, потомство не может наследовать чужеродный ген от трансгенной родительской формы. Установлено, что примерно 30% первичных трансгенных животных являются мозаиками. В этой связи трансген не передается потомству согласно законам Менделя с частотой 50%. Часть мозаиков вообще не может дать начало трансгенным линиям, так как у них отсутствует передача по наследству.

Трансгенные технологии разрабатывались и со­вершенствовались на лабораторных мышах. С начала 1980-х гг. в различные линии мышей были введены сотни генов. Эти исследования в зна­чительной мере способствовали установлению механизмов генной регуляции и развития опухо­лей, природы иммунологической специфично­сти, молекулярной генетики роста и развития, других фундаментальных биологических процес­сов. Трансгенные мыши сыграли свою роль в ис­следовании возможности крупномасштабного синтеза лекарственных веществ, а также в созда­нии трансгенных линий, позволяющих модели­ровать различные генетические болезни челове­ка. Введение чужеродной ДНК мышам осуществлялось разными методами: 1) с помощью ретровирусных векторов, инфицирующих клетки эмбриона на ранних стадиях развития перед им­плантацией эмбриона в самку-реципиента; 2) микроинъекцией в увеличенное ядро спермия (мужской пронуклеус) оплодотворенной яйце­клетки; 3) введением генетически модифицированных эмбриональных стволовых клеток в предимплантированный эмбрион на ранних стадиях развития.

Использование ретровирусных векторов. Преимущество метода, основанного на исполь­зовании ретровирусных векторов, пе­ред другими методами трансгеноза состоит в его эффективности. Однако размер вставки в этом случае ограничивается 8 т. п. н., вследствие чего трансген может оказаться лишенным прилегаю­щих регуляторных последовательностей, необ­ходимых для его экспрессии.

Использование ретровирусных векторов имеет и еще один большой недостаток. Хотя эти векторы создаются так, чтобы они были дефект­ными по репликации, геном штамма ретровиру­са (вируса-помощника), который необходим для получения большого количества векторной ДНК. может попасть в то же ядро, что и трансген. Несмотря на все принимаемые меры, ретровирусы-помощники могут реплицироваться в организме трансгенного животного, что совер­шенно недопустимо, если этих животных пред­полагается использовать в пищу или как инстру­мент для получения коммерческого продукта. И поскольку существуют альтернативные методы трансгеноза, ретровирусные векторы редко ис­пользуются для создания трансгенных живот­ных, имеющих коммерческую ценность.

Метод микроинъекций ДНК. В настоящее время для создания трансгенных мы­шей чаще всего используют метод микроинъекций ДНК. Он заключается в следующем. Работу начинают со стимуляции гиперовуляции у самок-доноров с целью увеличения числа яйцеклеток, в которых бу­дет инъецирована чужеродная ДНК. Сначала самкам вводят сыворотку бере­менной кобылы, а спустя примерно 48 ч — хорионический гонадотропин человека. В результате гиперовуляции образуется при­мерно 35 яйцеклеток вместо обычных 5—10. Затем производят скрещивание с самцами самок с гиперовуля­цией, после чего их умерщвляет, вымывают из яйце­водов оплодотворенные яйцеклетки, и сразу инъецируют ДНК в оплодотворенные яй­цеклетки. Часто вводимая трансгенная конструкция нахо­дится в линейной форме и не содержит прокариотических векторных последовательностей.

У млекопитающих после проникновения сперматозоида в яйцеклетку ядро спермин (муж­ской пронуклеус) и ядро яйцеклетки существуют раздельно. После того как последнее заканчивает митотическое деление и становится женским пронуклеусом, может произойти слияние ядер (кариогамия). Мужской пронуклеус обычно го­раздо больше женского, его легко локализовать с помощью секционного микроскопа и ввести в него чужеродную ДНК. При этом яйцеклетку на время проведения микроинъекции можно пере­мещать, ориентировать нужным образом и фик­сировать. Опытный экспериментатор за день мо­жет инокулировать несколько сотен яйцеклеток.

После введения ДНК от 25 до 40 яйцеклеток имплантируют микрохирургическим путем в «сур­рогатную» мать, у которой вызывают ложную бе­ременность скрещиванием с вазэктомированным самцом. У мышей спаривание — это единствен­ный известный способ подготовки матки к им­плантации. Поскольку вазэктомированный самец сперматозоидов не продуцирует, ни одна из яйце­клеток «суррогатной» матери не оплодотворяется. Эмбрионы развиваются только из введенных яй­цеклеток, и мышата рождаются спустя примерно 3 нед после имплантации.

Для идентификации трансгенных животных выделяют ДНК из маленького кусочка хвоста и тестируют ее на наличие трансгена с помощью блот-гибридизации по Саузерну методом ПЦР. Чтобы опре­делить, находится ли трансген в клетках зароды­шевой линии животного, трансгенную мышь скрещивают с другой мышью. Далее можно про­водить скрещивание потомков для получения чистых (гомозиготных) трансгенных линий.

Описанный подход кажется на первый взгляд относительно простым, однако он требует четкой координации разных этапов. Даже высококвали­фицированному специалисту удается получить жизнеспособных трансгенных животных в луч­шем случае лишь из 5% инокулированных яйце­клеток. Ни один из этапов экспери­мента не эффективен на все 100%, поэтому для микроинъекций необходимо использовать большое число оплодотворенных яйцеклеток. На­пример, при получении трансгенных мышей после инъекции ДНК выживают только 66% оп­лодотворенных яйцеклеток; мышата развива­ются примерно из 25% имплантированных яй­цеклеток, причем трансгенными из них оказываются лишь 25%. Таким образом, из 1000 имплантированных оплодотворенных яйцекле­ток развивается от 30 до 50 трансгенных мышат. Кроме того, введенная ДНК может интегриро­вать в любое место в геноме, и зачастую множе­ство ее копий включаются в один сайт. И, нако­нец, не все трансгенные мышата будут обладать нужными свойствами. В организме некоторых особей трансген может не экспрессироваться из-за неподходящего окружения сайта интегра­ции, а в организме других число копий чуже­родного гена может оказаться слишком боль­шим, что может привести к гиперпродукции белка и нарушению нормальных физиологиче­ских процессов. И все же, несмотря на все это, метод микроинъекций используют для получе­ния линий мышей, несущих функциональные трансгены, довольно часто.

Использование модифицированных эмбриональных стволовых клеток. Клетки, выделенные из мышиных эмбрионов на стадии бластоцисты, могут пролиферировать в культуре, сохраняя способность к дифференцировке в любые типы клеток, в том числе и в клетки зародышевой линии, при введении в другой эмбрион на стадии бластоцисты. Такие клетки называются плюрипотентными эмбрио­нальными стволовыми клетками ( ES ). ES-клетки в культуре легко модифицировать методами генной инженерии без нарушения их плюрипотентности. Например, в определенный сайт не­существенного гена в их геноме можно встроить функциональный трансген. Затем можно ото­брать измененные клетки, культивировать их и использовать для получения трансгенных жи­вотных. Это позволяет избежать слу­чайного встраивания, характерного для метода микроинъекций и ретровирусных векторных си­стем.

При трансфекции ES-клеток в культуре век­тором, предназначенным для интеграции в спе­цифический хромосомный сайт, в некоторых клетках ДНК встраивается случайным образом, в других встраивание происходит в нужный сайт, в большинстве же ES-клеток интеграции вообще не происходит. Для увеличения числа клеток первого типа используют так называе­мую позитивно-негативную селекцию. Эта стратегия состоит в позитивной селекции кле­ток, несущих векторную ДНК, встроившуюся в нужный сайт, и негативной селекции клеток с векторной ДНК, интегрировавшей в случайный сайт.

Сайт-мишень должен находиться в такой об­ласти геномной ДНК, которая не кодирует важ­ных белков, чтобы интеграция чужеродной ДНК не повлияла на процессы развития или клеточ­ные функции. Кроме того, существенно, чтобы встраивание трансгена не блокировало трансля­цию соответствующего участка генома. Поиск подобных сайтов ведется непрерывно.

Более простой способ идентификации ES -клеток, несущих трансген в нужном сайте, осно­ван на использовании ПЦР. В этом случае ДНК-вектор содержит два участка, гомологичных сайту-мишени, по одному со стороны трансгена и со стороны клонированной бактериальной или синтетической (уникальной) последова­тельности, отсутствующей в геноме мыши. После трансфекции ES -клеток этим век­тором проводят скрининг трансфицированных клеток методом ПЦР. Один из ПЦР-праймеров комплементарен участку клонированной бактериальной или синтетической (уникаль­ной) нуклеотидной последовательности интег­рировавшего вектора, а второй - участку хромосомной ДНК, прилегающему к одному из гомологичных участков ДНК. При встраивании последовательности-мишени в случайный сайт ожидаемый продукт амплификации образовы­ваться не будет, а при сайт-специ­фической интеграции в результате ПЦР-ампли­фикации образуется фрагмент ДНК известного размера. Таким образом можно идентифицировать пулы ES-клеток, содержа­щих трансген в нужном сайте, а пересевая клет­ки из этих пулов — получить клеточные линии с сайт-специфической вставкой.

ES-клетки, в геном которых в нужном сайте встроен трансген, можно культивировать и ввести в эмбрион на стадии бластоцисты, а затем им­плантировать такие эмбрионы в матку псевдобе­ременных «суррогатных» матерей. Мышата, у которых генетически модифицированные ES-клетки участвовали в образовании клеток заро­дышевой линии, могут дать начало трансгенным линиям. Для этого их нужно скрестить с особями той же линии, а затем скрестить их трансгенных потомков. В результате будут получены транс­генные мыши, гомозиготные по трансгену.

В принципе подходы к созданию трансген­ных животных с «улучшенными функциями» и с «потерей функций» сходны. К сожалению, плюрипотентные ES-клетки, аналогичные таковым у мышей, пока не обнаружены у крупного рога­того скота, овец, свиней и цыплят, но их поиск продолжается.

Трансгенные мыши могут служить модельными системами для изучения болезней человека и тест-системами для исследования возможности синтеза продуктов, представляющих интерес для медицины. Используя целых животных, можно моделировать и возникновение патологии, и ее развитие. Однако мышь — не человек, хотя она тоже относится к классу млекопитающих, поэто­му данные, полученные на трансгенных моделях, не всегда можно экстраполировать на человека в том, что касается медицинских аспектов. Тем не менее, в некоторых случаях они позволяют вы­явить ключевые моменты этиологии сложной бо­лезни. Принимая во внимание все это, ученые разработали «мышиные» модели таких генети­ческих болезней человека, как болезнь Альцгеймера, артрит, мышечная дистрофия, образова­ние опухолей, гипертония, нейродегенеративные нарушения, дисфункция эндокринной сис­темы, сердечно-сосудистые заболевания и многие другие.

Для создания трансгенных коров исполь­зуют модифицированную схему трансгено­за мышей методом микроинъекций ДНК. Процедура включает следующие основные этапы: сбор ооцитов коров, забитых на скотобойне; созревание ооцитов in vitro ; оплодотворение бычьей спермой in vitro ; центрифугирование оплодотворенных яйце­клеток для концентрирования желтка, кото­рый в нормальных яйцеклетках мешает визу­ализации мужского пронуклеуса с помощью секционного микроскопа; микроинъекция ДНК в мужской пронуклеус; развитие эмбрионов in vitro ; нехирургическая имплантация одного эмб­риона реципиентной самке во время течки; скрининг ДНК потомков на наличие транс­гена.

 Перенос генов у сельскохозяйственных животных может быть использован в улучшении продуктивности и качества животноводческой продукции, повышении устойчивости к болезням и создании трансгенных животных - биореакторов ценных биологически активных веществ. Эрнст Л.К. (1996) сообщает, что у трансгенных свиней с геном гормона роста конечная живая масса была на 15,7% выше, чем у контрольных животных. По данным Брем Г. и др. (1991), у потомства трансгенных свиней, получавших соответствующий модифицированный кормовой рацион с повышенным содержанием протеина и дополнительным количеством лизина, отмечались более высокие среднесуточные привесы. В противоположность этим результатам нередки случаи эспрессии трансгенов без фенотипического эффекта. Это выяснилось уже в первой работе (R.E.Hammer et al., 1985) - при переносе гена гормона роста человека, когда были получены трансгенные кролики, свиньи и овцы, но ни в одном из случаев экспресии гормона роста человека не наблюдалось каких-либо фенотипических изменений у животных. V . G . Pursel et al . (1987) с этим же геном получили поросят с установленной экспрессией этого гена, но также без изменения скорости роста. Эти же исследователи (1988;1989) у трансгенных свиней с геном гормона роста также не регистрировали соответствующего ускорения роста. Трансгенные овцы с геном гормона роста имели повышенный его уровень, но не отличались от контрольных по интенсивности роста. Однако трансгенные свиньи имели более чем двукратное уменьшение толщины шпика, а у трансгенных овец содержание жира было примерно в 4-5 раз меньше, чем у контрольных аналогов. В связи с этим был высказан ряд предложений, одно из которых связывает отсутствие специфического фенотипического эффекта у животных со слабым узнаванием его рецепторами молекул чужеродного гормона или с посттрансляционными модификациями (K.A.Ward, C.D.Nancarrow, 1991). Это предположение вскоре получает экспериментальное доказательство на активно растущих свиньях, в геном которых были встроены дополнительные копии гена собственного гормона роста (V.D.Vize et al., 1988). Однако последующие опыты на овцах дали другой результат. Надежды на то, что в организме овцы ее собственный ген будет “работать” лучше, чем чужеродный, не оправдались. Трансгенные овцы с высоким содержанием овечьего гормона роста демонстрировали слабый прирост живой массы и были физиологически ненормальны.

Разницу по скорости роста между трансгенными мышами и трансгенными с.-х. животными некоторые исследователи объясняют следующим образом. Большинство свиней, использованных в экспериментах по переносу генов, происходили из популяций, в которых длительное время велась селекция по ростовой продуктивности, тогда как в линии мышей не велся отбор по этому показателю. Действительно, мыши, в популяции которых в течение 30 поколений осуществлялась селекция по скорости роста, имели незначительно меньшую живую массу по сравнению с трансгенными сверстниками. Следовательно, введение чужеродного гена в популяцию линий мышей, не подвергнутых селекции на скорость роста, вызывает скачок на более высокий ростовой уровень. Генетический потенциал роста в популяциях свиней, наоборот, находится недалеко от потенциального плато, и поэтому дополнительное введение гормона роста или перенос его гена не дает значительного эффекта в скорости роста. Другое объяснение отсутствия ускорения роста трансгенных животных связывают с необходимостью увеличения не только гормона роста, но и каких-то других, пока не известных стимуляторов роста.

Нерегулируемая экспрессия гена гормона роста, как аутологичного, так и гетерологичного, может привести к сокращению продолжительности жизни трансгенных животных вследствие патологических нарушений обмена веществ, развития акромегалии (чрезмерное разрастание отдельных частей лица, конечностей и внутренних органов) и подверженности различным инфекционным заболеваниям. Например, у трансгенных овец с повышенным содержанием в крови гормона роста крупного рогатого скота развился сахарный диабет - типичный симптом акромегалии (С.E. Rexroad et al., 1990). В другой работе сахарный диабет был отмечен у трансгенных овец, активно экспрессирующих собственный гормон роста. Животные пали в течение первого года постнатальной жизни (C.D.Nancarraw et al., 1991; K.A.Ward et al., 1989). Трансгенные свиньи с гиперсекрецией гормона были меньше по живой массе при рождении, чем однопометное потомство, более вялые, с угнетенным аппетитом, склонностью к артритам, и большинство из них также не жило больше года (V.G.Pursel et al., 1987, 1989). Стало очевидным, что постоянно высокий уровень продукции гормона роста у животных не является положительным фактором их продуктивности. Анализ этих экспериментов свидетельствует о том, что использование трансгенной технологии для изменения роста и состава тканей домашних животных требует углубления понимания процессов генетической регуляции роста. По мнению Л.К.Эрнста и соавт. (1993), направленное воздействие на один гормон комплексного гормоноростового каскада не будет эффективным, пока не будут созданы сложные конструкции генов с тонкой регуляцией процессов метаболизма.

Создание трансгенных животных открывает реальные перспективы улучшения качества или состава продуктов животноводства. Например, появилась возможность уменьшения лактозы в молоке путем создания трансгенных коров и овец, которые имеют специфический для молочной железы промотор (участок ДНК, с которым связывается РНК-полимераза, чтобы начать синтез мРНК), сцепленный с геном лактозы. При этом уже в молоке коров (овец) лактоза может быть расщеплена на глюкозу и галактозу. Такое молоко могло бы быть использовано в питании новорожденных детей, страдающих наследственной непереносимостью лактозы. Таким детям в грудном возрасте молоко следует давать только после его обработки ферментными препаратами. Кроме того, молоко могло бы быть полезно при различных желудочно-кишечных заболеваниях человека, сопровождающихся снижением активности лактазы (бета-галактозидазы). Наличие в молоке разнообразной микрофлоры создает проблемы, связанные с хранением, переработкой, потреблением молока и здоровьем животных. В этой связи конструируются гены, ответственные за выработку антител против определенных патогенных микроорганизмов (R.D.Bremel et al., 1989; U.H. Weidle et al., 1991). Важной задачей является и получение молока и молочных продуктов, содержащих термостабильный фермент лизоцим микробного происхождения. При пастеризации молока такой фермент, обладающий выраженным антибактериальным свойством, не потеряет своей активности, что значительно увеличит сроки хранения молока и получаемых из него продуктов. В кислой среде желудочно-кишечного тракта лизоцим инактивируется. Рассматривается возможность введения генов, кодирующих антитела с протективными свойствами в отношении патогенных микробов - возбудителей маститов коров.

Сотрудниками Института цитологии и генетики СО РАН (г.Новосибирск) и Института молекулярной генетики РАН (г.Москва) создана генетическая конструкция pGoatcasGMCSF, которая содержала регуляторный район гена альфа-S1-казеина козы, несущая ген гранулоцит-макрофаг колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) человека (И.А.Серова и соавт., 2011). В экспериментах по инъекции этой рекомбинантной ДНК в пронуклеусы зигот были получены 4 трансгенных мыши. Методом ПЦР показана тканеспецифичность экспрессии ГМ-КСФ человека только в молочной железе лактирующих самок. Поскольку упомянутая конструкция является тканеспецифичной, она подпадает под регуляцию физиологических сигналов беременности и лактации. 

Достижения генной инженерии могут быть использованы в изменении качества и выхода шерсти овец. Дальнейшее усовершенствование шерстных характеристик овец в определенной степени зависит от степени снабжения волосяных фолликулов питательными веществами, необходимыми для их активного функционирования. Главным препятствием физиологи считают ограничение запаса энергии для обеспечения процессов клеточной пролиферации и аминокислот (лизина, метионина, аргинина, гистидина и цистеина) для синтеза кератинов фибринов шерсти. Ферментативные процессы, вызываемые микрофлорой рубца, не всегда полностью обеспечивают синтез необходимых аминокислот, так как при расщеплении протеинов корма большая часть их уходит на синтез микроорганизмами собственных белков, что снижает уровень важных для роста шерсти аминокислот. Поэтому первоочередной задачей технологии рекомбинантных ДНК, направленной на улучшение характеристик шерсти овец, является увеличение эффективности усвоения корма овцами. 

С целью увеличения количества серусодержащих аминокислот (например цистеина), необходимых для биосинтеза кератиновых белков шерсти овец, Rogers G.E. (1990) считает целесообразным создание трансгенных овец, имеющих в своем геноме бактериальные гены, кодирующие синтез цистеина. Эти гены должны экспрессироваться только в эпителии желудочно-кишечного тракта овцы и обусловливать использование серы, образующейся в результате ферментативных процессов микроорганизмов. Им получен первый трансгенный ягненок, содержащий в своем геноме гены серинацетилтрансферазы (SAT) и О-ацетилсеринсульфгидрилазы (OAS) из Salmonella typhimurium. K . A . Ward et al . (1990) использовали SAT и OAS кишечной палочки, соединенные с генной конструкцией, состоящей из промотора металлотионина-1а овцы, вызывающего цинкзависимую экспрессию. Исследования в этом направлении продолжаются. 

Все более важное значение приобретает селекция животных по устойчивости к заболеваниям. В отличие от вакцинации, эффект действия которой проявляется в течение жизни конкретных индивидуумов, генно-инженерный иммунитет может иметь наследственный характер, что позволит вывести линии с.-х. животных, резистентных к определенным инфекционным болезням. Резистентность к ряду заболеваний является полигенным признаком. Например, устойчивость к трипаносомозу определенных африканских пород крупного рогатого скота наблюдается на фоне их жаровыносливости и нетребовательности к условиям кормления и содержания. Вместе с тем резистентность организма может основываться и на единичных генах. В качестве примера можно привести устойчивость к диарее у новорожденных поросят или резистентность к гриппу у мышей. Это послужило основанием для получения животных с трансгенами, которые, возможно, создадут иммунитет к отдельным инфекционным заболеваниям. В этом направлении генно-инженерных работ на первый план выступают исследования специфического антивирусного эффекта генов моноклональных антител. Механизм действия последних должен быть в известной степени аналогичен специфической антивирусной иммунизации животных. Получены трансгенные мыши, продуцирующие антитела против специфических антигенов без предварительной иммунизации или контакта с инфекцией (Storb U., 1987). Гены легкой и тяжелой цепей моноклональных антител против 4-гидрокси-3-нитрофенилацетата были интегрированы в геном кроликов и свиней (U.Weidle et al., 1991). Титр специфических антител в сыворотке крови трансгенных животных оказался равным соответственно 100 и 1000 мкг/мл. Имеются сообщения о получении трансгенных мышей, овец и свиней с генными конструкциями, кодирующими альфа- и хи-цепи антител против фосфорилхолина (D.Lo et al., 1991). Авторы наблюдали высокий уровень IgA мыши, но только у трансгенных мышей и свиней. Г.Брем и др. с 1991 года выделили и клонировали ген мышей Мх, ответственный за иммунитет к вирусу гриппа А, и ведут работу по получению трансгенных свиней на основе использования данного гена. Исследуется возможность получения трансгенных животных, имеющих повышенную концентрацию лактоферина в тканях молочной железы, с целью повышения устойчивости к маститу. Ведутся работы и по получению животных, имеющих в своем геноме трансген антисмысловой РНК. Экспрессия последней в клетках приводит к гибридизации со смысловой РНК, в результате чего подавляется репликация вирусного гена. Так, российскими учеными (Т.И. Тихоненко, М.И. Прокофьев., Л.К. Эрнст., 1991) был сконструирован ген антисмысловой РНК против аденовируса и получены трансгенные кролики. Клеточные линии животных (культура клеток из почек), имеющие трансген, показали высокую резистентность против аденовируса по сравнению с контрольными линиями клеток. Эти же исследователи продемонстрировали устойчивость животных с трансгеном антисмысловой РНК против лейкоза крупного рогатого скота на организменном уровне к заражению вирусом - возбудителем этой болезни. Так, у трансгенных кроликов с упомянутым геном титр антител против антигена р24 был значительно ниже (1:500), чем у контрольных животных (1:8000). Показана возможность создания внутриклеточной иммунизации против некоторых вирусов. Получены трансгенные куры, клетки которых экспрессировали капсидный белок вируса лейкоза, что и способствоало  устойчивости их к этой болезни. 

Известно о существовании пород с наследственной устойчивостью к бакте­риальным инфекционным заболеваниям — мас­титу (коровы), дизентерии (новорожденные по­росята), холере (домашняя птица). Если в основе устойчивости к каждой из этих болезней лежит один ген, можно попытаться создать не­сущих его трансгенных животных. В настоящее время для борьбы с инфекционными заболева­ниями домашних животных используют при­вивки и лекарственные препараты. Заболевших животных изолируют, за здоровыми ведут тща­тельное наблюдение. Стоимость всех этих меро­приятий может достигать 20% общей стоимости конечной продукции.

Для выведения линий животных, устойчивых к возбудителям инфекций, можно использовать другой подход, заключающийся в создании пу­тем трансгеноза наследуемых иммунологиче­ских механизмов. С этой точки зрения рассмат­ривают самые разные гены, ответственные за работу иммунной системы: гены основного комплекса гистосовместимости, Т-клеточных рецепторов, лимфокинов. Наиболее обнадежи­вающими на настоящее время являются предва­рительные результаты, полученные при введе­нии мышам, кроликам и свиньям генов, кодирующих Н- и L -цепи какого-либо моноклонального антитела. Идея этого подхода за­ключается в том, чтобы снабдить трансгенное животное наследуемым механизмом защиты, позволяющим обойтись без иммунизации с по­мощью прививок.

Введение в организм реципиента генов ан­тител, которые связываются со специфиче­скими антигенами, было названо иммуниза­цией in vivo . Для этого гены Н- и L -цепей иммуноглобулинов моноклонального мышиного антитела к антителу, связывающемуся с 4-гидрокси-З-нитрофенилацетатом, вводили с помощью микроинъекций в оплодотворенные яйцеклетки мыши, кролика и свиньи. Во всех случаях в сыворотке трансгенных животных обнаруживалась соответствующая активность моноклонального антитела. Однако количест­во моноклональных антител, содержащих це­пи Н- и L -, было невелико. Чтобы установить, можно ли решить эту проблему, необходимо протестировать различные трансгенные кон­струкции.

Возможность включения в клетки организма генов, ответственных за синтез белков, имеющих большую значимость в медицине и ветеринарии, создало основу стратегии использования трансгенных животных в качестве биореакторов. Большинство таких белков и по сей день выделяются из тканей и биологических жидкостей человека. Например, фактор свертываемости, интерферон, альфа-1-антитрипсин и другие белки получают из крови, гормон роста - из гипофиза. Они производятся в малых количествах из-за дороговизны и трудности выделения человеческих тканей. Кроме того, они могут быть заражены патогенными микроорганизмами, такими как возбудители гепатита, СПИДа и др.

Трансгенные животные, используемые для производства ценных биопрепаратов, имеют ряд преимуществ перед микроорганизмами-продуцентами, а также клеточными системами. В простых рекомбинантных системах микроорганизмов гликолизирование, В-гидроксилирование или карбоксилирование белков млекопитающих в большинстве случаев невозможно или возможно, но с недостаточной точностью. Это приводит к изменению структуры белков, что не может не отразиться на их биологической активности. Наряду с этим в препаратах, используемых человеком в качестве лечебных средств, нежелательна примесь бактериальных белков. Основным недостатком генно-инженерных культуральных клеток является низкий выход белка. Промышленные реакторы, используемые для культивирования клеток-продуцентов, являются дорогими, как в отношении их стоимости, так и в отношении их обслуживания. Создание трансгенных животных также требует больших средств и к тому же дело не из легких, но однажды выведенная линия таких животных может продуцировать большое количество белков с низкой стоимостью, что позволит окупить все расходы за короткое время. Получение биологически активных белков человека от трансгенных с.-х. животных гарантирует их экологическую чистоту и экологическую чистоту самого производства, которое практически сводится к эксплуатации животных-продуцентов.

Чужеродные белки могут быть синтезированы большинством тканей тела животного. Экспрессии трансгенов в определенных органах можно достичь путем комбинации структурных генов со специфическими регуляторными элементами. Весомые успехи в производстве биореакторов были достигнуты в целенаправленной экспрессии трансгенов в эпителиальных клетках молочной железы. Структурный ген, связанный с промотором гена молочного протеина (казеина, лактоальбумина, лактоглобулина), в первую очередь будет экспрессироваться в клетках молочной железы. Это позволяет получать полезную продукцию с молоком.  

Выбор молочной железы как места производства чужеродных протеинов обосновывается огромной ее белковой продуктивностью. Общее содержание молочных белков в зависимости от вида животного колеблется в пределах 2-10%, т.е. на уровне 20-100 граммов на литр. Для коммерческого производства белков, имеющих фармацевтическую значимость, уже достаточно одного и более граммов рекомбинантного белка. Наиболее эффективным «биореактором» является крупный рогатый скот, который еже­годно при удое 5 тыс л. молока, может давать примерно 35 г белка на 1 л. Если в молоке будет содержаться такое количество рекомбинантного белка и эффективность его очистки составит 50%, то от 20 трансгенных коров можно будет получать 50 кг такого белка в год. Образно говоря, достаточно по две коровы для того, чтобы полностью удовлетворить годовую потребность в белке С, использующегося для предотвращения тромбообразования, и фактора IX - (фактора Кристмаса) каскадного механизма свертывания крови.

 На сегодняшний день известен ряд рекомбинантных белков, таких как человеческий белок С, антигемофильный фактор 1Х, альфа-1-антитрипсин, тканевой плазменный активатор, лактоферин, человеческий сывороточный альбумин, интерлейкин-2, урокиназа, химозин и др., полученных из молока трансгенных животных. Работы по получению указанных белков, за исключением альфа-1-антитрипсина и химозина, находятся на уровне лабораторных исследований и не достигли стадии, которая бы представляла коммерческий интерес. Одна из целей трансгеноза крупного рогато­го скота — изменение содержания в молоке раз­личных компонентов. Так, количество сыра, по­лучаемого из молока, прямо пропорционально содержанию в нем к-казеина, поэтому весьма перспективным представляется увеличение ко­личества синтезируемого к-казеина с помощью гиперэкспрсссии трансгена этого белка.

В 1992 году ученые Великобритании получили трансгенных овец - продуцентов человеческого альфа-1-антитрипсина, используемого для лечения людей, больных эмфиземой легких. Этот препарат получают исключительно из донорской крови (1г альфа-1-антитрипсина стоит 110 долл.США). У четырех голов концентрация данного белка была в пределах 1 г/л, а у одной достигала 35 г/л, что соответствует половине всех белков в молоке. При таком уровне продукции одна овца в год даст столько белка, сколько необходимо для лечения 50 пациентов.

Российские ученые (Л.К.Эрнст, Г.Брем, М.И.Прокофьев, И.Л.Гольдман и др.) получили трансгенных овец, секретирующих с молоком фермент химозин в концентрации 200-300 мг/1л. Химозин - основной компонент в производстве сыра, получаемый из сычугов молочных телят и ягнят. При этом стоимость химозина, получаемого из нового источника, будет дешевле в 5-10 раз. По расчетам авторов из трех литров молока трансгенной овцы можно получить такое количество фермента, которое достаточно для производства одной тонны сыра из коровьего молока.

Экспрессия трансгенов в клетках молочных желез овец и коз не оказыва­ла никаких побочных действий ни на самок в период лактации, ни на вскармливаемое потом­ство. В отличие от этого при введении свиньям трансгена бычьего гормона роста под контролем промотора металлотионина неблагоприятные эффекты наблюдались. Количество гормона у разных особей в группе трансгенных свиней различалось, однако в целом вся эта группа бы­стрее прибавляла в весе. К сожалению, этот по­ложительный результат частично обесценивался различными патологиями: у животных отмеча­лись язва желудка, почечная недостаточность, хромота, воспаление перикарда, уменьшение подвижности суставов, предрасположенность к пневмонии. Причины этих симптомов неиз­вестны. Возможно, они связаны с долговремен­ным присутствием в организме избытка гормона роста. В этих экспериментах трансген синтези­ровался более или менее непрерывно. Были соз­даны также трансгенные овцы с повышенной скоростью роста шерсти. Для этого кДНК овечьего инсулиноподобного фактора роста I была помешена под контроль мышиного промо­тора гена кератина с высоким содержанием се­ры, что обеспечивало гиперэкспрссию кДНК. При этом у трансгенных овец в отличие от сви­ней никаких нежелательных побочных эффек­тов не наблюдалось.

Положительные результаты были получены и в ходе экспериментов с трансгенными свинья­ми. Например, были созданы здоровые транс­генные свиньи, в геноме которых присутствова­ла следующая генетическая конструкция: регуляторная область гена бета-глобина человека, два гена альфа 1- глобулина человека и один ген бета А - гло­бина человека. В результате ее экспрессии в клетках крови свиней синтезировался человеческий гемоглобин, при этом в результате замены человеческого промотора гена бета-глобина сви­ным человеческий гемоглобин синтезировался в значительно большем количестве. Человече­ский гемоглобин, продуцируемый трансгенны­ми свиньями, обладал такими же химическими свойствами, что и природный человеческий. Его можно было очистить от гемоглобина свиней обычной хроматографией.

Эти результаты указывают на принципиаль­ную возможность замены цельной крови, ис­пользуемой при трансфузии, человеческим ге­моглобином, полученным методом трансгеноза. Однако изолированный гемоглобин переносит кислород не так эффективно, как гемоглобин в составе эритроцитов. Более того, он быстро раз­рушается в организме животного, которому был введен, а продукты его распада токсичны для почек. Таким образом, получение заменителя человеческой крови с помощью трансгеноза — это дело далекого будущего.

В последнее время большое внимание уделя­ется вопросу об использовании органов живот­ных для трансплантации человеку. Основная проблема межвидовой трансплантации — это гиперострое отторжение. Гиперострое отторжение влечет за собой связывание антител организма-хозяина с углеводной антигенной детерминантой на поверхности клеток пересаженного орга­на. Связавшиеся антитела вызывают острую воспалительную реакцию (активацию каскада комплемента), происходит массовая гибель не­сущих антитела клеток и быстрая потеря переса­женного органа.

В естественных условиях воспалительная ре­акция блокируется особыми белками на поверх­ности клеток, выстилающих стенки кровенос­ных сосудов. Эти белки -   ингибиторы комплемента видоспецифичны. Было высказа­но предположение, что если бы животное-донор несло один или несколько генов человеческого белка, ингибирующего комплемент, то переса­женный орган был бы защищен от первичной воспалительной реакции. С этой целью были получены трансгенные свиньи, несущие различ­ные человеческие гены ингибитора комплемен­та. Клетки одного из этих животных оказались совершенно нечувствительными к компонентам системы каскада комплемента. Предварительные эксперименты по пересадке органов трансгенных свиней приматам показали, что ткани пересаженного органа повреждаются слабее, а сам орган не отторгается немного дольше. Воз­можно, трансгенные свиньи, несущие человече­ский ген ингибитора комплемента и лишенные основного поверхностного белка клеток свиней, который вызывает острейшее отторжение, будут служить источником органов для транспланта­ции человеку.

Обнадеживающей оказалась первая работа по получению трансгенных животных - продуцентов интерлейкина-2. Последний, являясь растворимым фактором Т-лимфоцитов хелперов, участвующих в пролиферации и дифференцировке Т-лимфоцитов киллеров, играет важную роль в обеспечении необходимого уровня иммунитета. С использованием генной конструкции, состоящей из ДНК бета-казеина кролика и структурного гена интерлейкина-2 человека, были получены кролики, секретирующие с молоком активную форму этого белка.                         

Таким образом, достигнута интеграция одного или нескольких генов в эмбрионы млекопитающих и доказана их экспрессия, а также передача потомству. Однако следует подчеркнуть трудности и неясности, с которыми по-прежнему связана техника получения трансгенных животных. Все еще слабо изучен механизм интеграции гена в клетки млекопитающего. Эта интеграция происходит случайным образом и не связана с конкретной областью хромосомы. Другая сложность обусловлена нестабильностью клеток, в которые вводится ген (гены): он может быть утрачен или модифицирован и в результате стать неактивным. Наконец, активность генов определяется не только последовательностями нуклеотидов, которые обеспечивают транскрипцию гена с образованием мРНК, но также другими последовательностями нуклеотидов, которые зачастую далеко стоят от собственного гена, и, если требуется достичь полной экспрессии гена, эти последовательности нужно вводить вместе с геном. Например, ген, ответственный за синтез альфа-глобулина, регулируется последовательностью ДНК, расположенной перед ним.

Достигнутые результаты генной инженерии в области получения трансгенных млекопитающих позволят углубить наши знания об экспрессии генов, что в перспективе облегчит перенос генов и определение факторов, способствующих более полному проявлению генетической информации, записанной в трансгенах. Кроме того, встраивание чужеродного гена в тот участок генома клетки, где в норме располагается гомологичный ген, возможно откроет путь для лечения генетических заболеваний, так как это позволит заменить дефектный или восполнить отсутствующий ген его активным аналогом.

Трансгенные птицы. Микроинъекция ДНК в оплодотворенные яйце­клетки птиц с целью получения трансгенных линий — непростая процедура. Это связано с не­которыми особенностями воспроизводства и развития птиц. Так, при оплодотворении у птиц в яйцеклетку могут проникнуть сразу несколько сперматозоидов, а не один, как это обычно бы­вает у млекопитающих, и идентифицировать тот мужской пронуклеус, который соединится с женским, становится невозможно. Метод мик­роинъекции ДНК в цитоплазму тоже не подхо­дит, поскольку в этом случае ДНК не интегри­руется в геном оплодотворенной яйцеклетки. Наконец, даже если удастся осуществить микро-инъекцию ДНК в ядро, дальнейшие операции будет трудно осуществить, поскольку у птиц яй­цеклетка после оплодотворения достаточно бы­стро обволакивается прочной мембраной, по­крывается слоем альбумина и внутренней и наружной известковыми оболочками.

Однако трансген можно вводить в область желтка (зародышевый диск), который содержит и женский, и мужской пронуклеусы и образует­ся раньше, чем скорлупа. После введения ДНК каждую яйцеклетку культивируют in vitro, и ко­гда образуется зародыш, его помешают в сурро­гатное яйцо, чтобы имитировать вылупление. При помощи такой стратегии была получена од­на линия трансгенных цыплят. Однако в насто­ящее время этот метод неэффективен и техниче­ски трудновыполним в обычных условиях.

К тому времени, когда наружная известковая оболочка яйцеклетки птиц затвердевает, заро­дыш, находящийся на стадии бластодермы, со­стоит из двух слоев по 40 000 и 80 000 клеток. Проведены эксперименты по инокуляции такого зародыша ретровирусными векторами с нару­шенной репликацией, несущими бактериальные маркерные гены. В результате были получены трансгенные цыплята и обыкновенные перепела, несущие чужеродные гены в клетках зародыше­вой линии. Обычно такие птицы не продуцируют свободных вирусных частиц и,  тем не менее, при­менение ретровирусных векторов в качестве «по­ставщиков» чужеродных генов животным, кото­рые затем могут использоваться в пищу, неизбежно вызывает вопросы относительно без­опасности такого подхода. Кроме того, размер трансгена, который может быть введен в орга­низм реципиента в составе ретровирусного век­тора, не превышает 8 т. п. н., а в некоторых слу­чаях интеграция в исходный сайт нестабильна. Все это заставило исследователей искать альтер­нативные способы трансгеноза.

Никаких специфичных для птиц ES-клеток не обнаружено, поэтому подход, основанный на их использовании, для птиц неприменим. Более перспективным представляется метод с исполь­зованием рекомбинантных эмбриональных кле­ток. Он состоит в следующем. Выделяют клетки бластодермы из куриного эмбриона, трансфицируют их с помощью катионных липидов (липосом), связанных с трансгенной ДНК (липосомная трансфекция), и повторно вводят в подзародышевую область свежеотложенных яиц. Часть потомков будет нести в каком-то неболь­шом количестве клетки донора: таких животных называют химерами. У некоторых химер клетки, произошедшие от трансфицированных клеток, могут образовывать линии зародышевых клеток, и после нескольких раундов скрещиваний таких химер можно получить линии трансгенных жи­вотных. Чтобы увеличить вероятность создания химер, несущих чужеродные гены в клетках за­родышевой линии, число донорских клеток в химерах можно увеличить облучением эмбрио­нов реципиента перед введением в них трансфи­цированных клеток. Под действием облучения некоторые (но не все) клетки бластодермы погибнут, и соотношение между трансфицированными клетками и клет­ками реципиента увеличится в пользу первых. По-видимому, таким образом можно получать трансгенных цыплят, хотя и с малой эффектив­ностью.

Трансгенных цыплят можно использовать для улучшения генотипа уже существующих по­род — для придания им (in vivo) устойчивости к вирусным инфекциям и заболеваниям, вызыва­емым кокцидиями, повышения эффективности усвоения пищи, снижения уровня жира и холестерола в яйцах, повышения качества мяса. Бы­ло предложено также использовать яйцо с его высоким содержанием белка в качестве источ­ника белковых продуктов, использующихся в фармацевтической промышленности. Экспрес­сия трансгена в клетках репродуктивного пути курицы, где обычно секретируется большое ко­личество овальбумина, может способствовать накоплению соответствующего белкового про­дукта в яйце, откуда его можно затем выделить.

Трансгенные рыбы. По мере истощения природных рыбных запасов все большую роль будет приобретать разведение рыбы в искусственных условиях. Основная цель исследований в этой области — создание реком­бинантных рыб путем трансгеноза. До настояще­го времени трансгены вводили микроинъекцией ДНК или электропорацией оплодотворенных яйцеклеток различных видов рыб — карпа, зу­батки, форели, лосося и т. д. Поскольку у рыб пронуклеус в оплодотворенной яйцеклетке пло­хо различим в обычный микроскоп, линеаризо­ванную трансгенную ДНК вводят в цитоплазму оплодотворенных яйцеклеток или клеток эмб­рионов, достигших стадии четырех бластомеров. Эмбриогенез у рыб протекает в водной среде вне организма, поэтому в имплантации нет необхо­димости. Все дальнейшие процессы могут про­текать в резервуарах с регулируемой температу­рой. Выживаемость эмбрионов рыб после микроинъекций довольно высока, от 35 до 80%, а доля трансгенных потомков колеблется от 10 до 70%. Трансген можно обнаружить с помо­щью ПЦР с использованием либо препаратов эритроцитов зародышей, либо суммарной ДНК. Скрещивая трансгенных рыб, можно вывести трансгенные линии.

Большинство первых исследований в этой области было направлено на исследование вли­яния трансгена гормона роста на скорость рос­та. В одном из экспериментов в яйцеклетки атлантического лосося был введен трансген, со­стоящий из следующих элементов: промотора гена антифризного белка американской бельдю­ги, кДНК гормона роста лосося, сигналов терминации/полиаденилирования 3'-конца гена антифризного белка американской бельдюги. Как правило, трансгенные лососи были крупнее и быстрее прибавляли в весе, чем контрольные нетрансформированные особи. В этом случае была выбрана система экспрессии с ускоренной транскрипцией гена гормона роста в холодной воде и пригодная для «всех рыб», что позволяло избежать биологической несовместимости, ко­торая могла бы возникнуть, если бы ген гормона роста происходил не из рыб. Годовалые трансгенные особи, полученные в результате введе­ния в яйцеклетки генетической конструк­ции гормона роста, подходящей для «всех лососей», весили примерно в 11 раз больше, чем нетрансгенные. Физиологическая активность линий таких трансгенных лососей в естествен­ных условиях вызывает значительный интерес. Предполагается, что в будущем гены устойчиво­сти к болезням и стрессовым воздействиям, а также гены, обуславливающие другие биологиче­ские особенности, будут введены как рыбам уме­ренных широт, так и тропическим рыбам.

Контрольные вопросы: Какие методы используются для введения чужеродной ДНК эмбрионам животных?; 2. Приведите примеры использования трансгенных животных для получения полезных продуктов; 3. Расскажите о достижениях генетической инженерии в селекции животных, устойчивых к различным заболеваниям; 4. Преимущества трансгенных животных перед микроорганизмами-продуцентами биопрепаратов; 5. Какие Вы знаете рекомбинантные белки, получаемые из молока сельскохозяйственных животных?; 6. Особенности методики создания трансгенных птиц и рыб.

 

Лекция №9

Лекция №10

Биотехнология и биобезопасность

Встраивание в ДНК реципиентной клетки чужеродного донорского гена сопряжено с определенными трудностями, главными из которых яв­ляются обеспечение адресной вставки гена или группы генов, а также их нормального функционирования – экспрессии. Эта проблема существу­ет постоянно и ее решение во многих случаях пока имеет случайный ха­рактер.

Еще более важной является проблема генетического риска, возмож­ного получения мутантов с содержанием токсичных или аллергенных для человека белков или других опасных соединений. Реальный риск, связан­ный с поведением чужеродного гена в реципиентной клетке, гипотетиче­ски всегда существует. Это, прежде всего, может вызываться плейотропным эффектом при взаимодействии и взаимозаменяемости генов. По мнению К.Г. Газаряна, дестабилизация генома при трансгенозе может про­исходить не только за счет обогащения генома новыми генами или мута­генного эффекта вставки, а, возможно, в силу индуцирования эндогенных систем рекомбинации и активации «молчащих» генов. Все это дает осно­вание считать теоретически возможным появление при трансгенозе опас­ных для здоровья и жизни человека генотипов.

Риск получения таких мутантов значительно возрастает при исполь­зовании искусственных, синтетических генов для получения трансген­ных растений, животных и микроорганизмов с улучшенными и принци­пиально новыми свойствами. Именно эти обстоятельства в определенной мере оправдывают тревогу многих людей, их настойчивое требование за­претить создание и особенно использование генетически модифициро­ванных организмов и получаемых из них пищевых и других продуктов или хотя бы ввести систему их обязательного маркирования.

К двум причинам можно добавить и третью – спонтанный перенос с пыльцой генов-модификаторов в другие растения, их взаимодействие с генами третьих генотипов, что может привести к появлению новых гено­типов с опасными свойствами для человека и окружающей среды.

Известно, что начало дискуссии по проблеме биобезопасности в нау­ке и обществе положили сами ученые – основатели нового направления – биоинженерии. В 1974 г. одиннадцать ведущих молекулярных биологов мира во главе с отцом генной инженерии американцем П. Бер­гом, создавшим первую рекомбинантную молекулу ДНК, обратились к мировому сообществу с письмом через журнал «Science », в котором предложили отказаться от экспериментов с рекомбинантными ДНК до проведения Международной конференции по этой проблеме. Однако уже в 1975 г. на конференции в Асиломаре (США) ученые пришли к выводу, что эксперименты в области генной инженерии, новейшей биотехноло­гии, не более опасны, чем аналогичные работы в других отраслях, но в них, как и везде, необходим строгий контроль за соблюдением мер биобезопасности.

В 1976 г. в США были приняты первые правила, регламентирующие работу с рекомбинантными микроорганизмами. В них запрещалось вы­пускать их за стены лабораторий. В конце 70-х годов в большинстве стран мира было разработано соответствующее законодательство. Постепенно эти правила корректировались в сторону смягчения жесткости требова­ний. Тридцать лет интенсивных работ в мире по новейшей биотехноло­гии – генетической инженерии – подтвердили их безопасность.

В лабораториях, осуществляющих генно-инженерные исследования и получение трансгенных организмов, не связанных с созданием биоло­гических средств поражения людей и природы, не зарегистрировано слу­чаев получения опасных для здоровья и жизни человека, а также для ок­ружающей среды генотипов растений и животных. Микробиологи целе­направленно ведут работы по усилению или ослаблению вирулентных и других свойств бактерий, решая ряд важных проблем медицинской био­безопасности и защиты государств от бактериологического оружия и аг­рессии. К сожалению, мировой терроризм не останавливается перед выбором средств для своих преступлений. Он использует в этих целях и опасные для жизни людей биоресурсы. Мировому сообществу предстоит срочно выработать и осуществить систему самых эффективных мер по пресече­нию терроризма и недопущения использования достижений биологиче­ской науки в его зловещих целях.

Ученые в состоянии обеспечить многолетнюю стабильность биобезо­пасности в биоинженерии. Ее можно объяснить следующими основными положениями. Во-первых, биоинженеры используют в своих работах природные гены, кото­рые на протяжении всей эволюции участвовали и участвуют в рекомбиногенезе, подвергаются отбору и элиминации, вследствие чего выработа­лись механизмы на всех уровнях организации биологических объектов, обеспечивающие устойчивый характер репарации процессов биосинтеза белков и их качества. Во-вторых, во всех биоинженерных лабораториях разработаны и постоянно применяются эффективные методы мониторинга за качеством получае­мых трансгенных организмов и, прежде всего, за качеством и свойствами белковых и других компонентов вновь созданных генотипов. Это позво­ляет заблаговременно, на этапе создания генетически моди­фицированных организмов (ГМО) в лаборатории, выявлять опасные для человека и окружающей среды генотипы и не допускать их выпуска из лаборатории для использования в производстве. По мнению большинства генных инженеров, методическая оснащен­ность мониторинга за созданием и использованием ГМО нуждается в дальнейшем совершенствовании. Должны быть разработаны новые мето­дики для своевременного выявления токсичных и аллергенных веществ у трансгенных объектов, охватывающие группы и классы соединений низ­комолекулярной природы. И, в-третьих, для создания генетически модифицированных организмов специа­листы отбирают известные, проверенные природные гены и их регуляторные генетические структуры. Созданные на их основе векторы обес­печивают получение трансгенов с заданными свойствами. В конечном итоге это и обеспечивает создание безопасных для людей и окружающей среды новых генотипов, получающих разрешение на использование в производстве.

В целом ситуация с генно-инженерными исследованиями по трансгенозу должна оставаться под строжайшим контролем ученых и государст­ва. По мнению ряда исследователей технология получения трансгенных животных далека от совершенства. Непредсказуемость результатов пере­носа чужеродных генов и наличие неожиданных эффектов ограничивает по их мнению практическое применение методов трансгеноза в животно­водстве. Ученые биоинженерных центров – мировых и националь­ных – должны активно развивать работы по совершенствованию техни­ки, методов, технологий и критериев биобезопасности ГМО. И только на такой основе они смогут ускорять процесс создания принципиально новых генотипов растений, животных и микроорганизмов для повышения устойчивости и продук­тивности агропромышленного производства, решения сложных проблем современной медицины и других направлений науки и экономики.

Критерий, показатели и методы оценки генетически модифицированных организмов и получаемых из них продуктов на биобезопасность. Важным этапом оценки биобезопасности генно-инженерно-модифицированных организмов и полученных из них пищевых и других продук­тов является санитарно-гигиеническая экспертиза. При этом должны проверяться: химический состав исходных и трансгенных растений; не ухудшилась ли биологическая ценность и усвояемость приготовленных из ГМО продуктов; не могут ли ГМО и полученные из них продукты вызывать аллергию или влиять на иммунную систему чело­века; не окажутся ли они токсичными, канцерогенными или мутаген­ными; не влияют ли чужеродные гены на репродуктивные функции животных и чело­века; не сможет ли введенный ген переноситься в другие организмы и будет ли пе­редаваться потомкам растений; не влияет ли новый ген на поражаемость растений болезнями и повреждаемость вредителями; не влияют ли трансгенные растения на почвенную микрофлору и другие составляю­щие биоценоза и др.

Обязательной и крайне важной является также медико-биологическая оценка пищевой продукции, полученной из ГМО. Например, в России разработаны методические указания «Медико-биологическая оценка пищевой продукции из генетически мо­дифицированных источников». Методическими указаниями установлены порядок гигие­нической экспертизы и государственной регистрации пищевой продук­ции, полученной из генетически модифицированных источников. Утвер­ждены методики медико-гигиенической, медико-биологической оценки и клинических испытаний новых видов пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников. Методические указания являются официальным изданием и их выполнение должно строго кон­тролироваться Минздравом РФ, а также соответствующими юридически­ми и правовыми органами.

Особенности государственного регулирования генно-инженерной деятельности и контроля за биобезопасностью получения и использования ГМО в США. Штаты занимают первое место в мире по объемам производства генетически модифицированной продук­ции.  В стране приняты законы и постановления Конгресса и президента, разрешающие использование ГМО в производстве. Половина посевов сои и четвертая часть посевов кукурузы в фермерских хозяйствах заня­ты трансгенными сортами и гибридами. За государственную регистрацию генетически модифицированных организмов отвечают три ведомст­ва – Министерство здравоохранения, Министерство сельского хозяйства и Министерство экологии. Принятие решения о регистрации или не реги­страции модифицированных организмов каждое из этих министерств принимает самостоятельно, независимо. Положительное решение может быть принято только на основании согласия всех трех ведомств. Департа­мент сельского хозяйства ( USDA), его Служба ветеринарной ин­спекции и защиты растений ( APHIS) в соответствии с утвержденными правилами и процедурой уведомления (нотификацией) принимает ре­шения о передвижении генетически модифицированных организмов между штатами, об импорте и выпуске их в окружающую среду. Эти правила впервые были опубликованы и вступили в силу еще в марте 1993 г.

Своевременное создание эффективной нормативно-правовой базы биотехнологии и биоинженерии было еще одним фактором, обес­печивающим ускоренное развитие науки и практики в области генно-ин­женерной деятельности. Главное направление в биоинженерии – создание генетически модифицированных сортов и гибридов сои, куку­рузы, хлопчатника, сахарной свеклы, картофеля, томатов, рапса и других культур, устойчивых к тотальному гербициду раундапу (глифосфату) грибным болезням и насекомым. Интенсивно также ведутся исследова­ния по созданию сортов пшеницы и других культур, устойчивых к гриб­ным и вирусным заболеваниям. Наибольшие успехи в создании устойчи­вых сортов и гибридов перечисленных выше культур, достигли ученые всемирно известной фирмы «Монсанто» (Сент-Луис, штат Миссури).

Никаких проблем с выращиванием и реализацией семян и зерна гене­тически модифицированных сортов и гибридов сои, кукурузы и других культур фермеры не испытывают и не выдвигают. За их счет они получают существенную добавку к прибыли, сокращая затраты на герби­циды и пестициды и уход за посевами. Обязательного маркирования продовольственных товаров, получен­ных из генетически модифицированных сортов и гибридов, в Штатах пока не вводили. По желанию покупателей его могут ввести на любом торго­вом предприятии в любое время.

Казахстан - подписант Картохенского Протокола. Изучение проблемы регулирования оборота ГМО на основе законодательства Картахенского Протокола (Cartagena Protocol of Biosafety), позволило Казахстану разработать проекты «Концепции государственного регулирования оборота и контроля ГМО в РК», а также ряда нормативных документов, и создать предпосылки для формирования системы их регулирования в РК. Проведенный анализ показал, что практически ни в одной стране нет законодательства, способного предотвратить непредсказуемые последствия при создании, использовании и распространении ГМО. Сегодня в мире существует два различных принципа при решении проблем регулирования ГМО: принцип «предосторожности», которого придерживается ЕС, и принцип «существенной эквивалентности», которого придерживаются США, Австралия, Канада и др.страны (Е.М.Раманкулов, 2011).

Проведенный мониторинг показал, что на рынки РК бесконтрольно поступает пищевая продукция, содержащая ГМ-ингридиенты. РК целесообразно придерживаться в своей политике принципа предосторожности, который основан на крайней осторожности в использовании ГМО и требует введения маркировки «Продукт содержит ГМО», что очень важно для обеспечения пищевой безопасности.

Важным положением Картахенского Протокола является право проводить оценку рисков продуктов генноинженерной деятельности для принятия решения относительно их импорта. В рамках выполнения принятых на себя обязательств, Правительство РК назначило Министерство сельского хозяйства – национальным координационным центром, Министерство образования и науки – компетентным органом. При этом первое министерство является контактным органом между Казахстаном и Секретариатом Протокола, а второе – отвечает за выполнение административных функций. Национальный центр биотехнологии РК определен как центр по реализции механизма посредничества по биобезопасности (МПБ). Последний действует в качестве центрального рынка информации, на котором происходит оперативный взаимный обмен информацией по биобезопасности между всеми сторонами Протокола.

В настоящее время разработан проект Закона РК «О государственном регулировании генно-инженерной деятельности», который в настоящее время находится на рассмотрении Парламента. Задачами данного законопроекта являются защита здоровья населения; охрана окружающей среды при использовании ГМО, сохранение биологического разнообразия; обеспечение безопасности страны при осуществлении генно-инженерной деятельности; развитие генно-инженерной деятельности и др.

Реакция мировой общественности на ускоренное развитие биотехнологии и биоинженерии в ведущих странах мира. Во многих странах ЕЭС сложилось отрицательное отношение обще­ственности к развитию биотехнологии, главным образом, к созданию и использованию генноинженерно-модифицированных организмов. Европарламент и правительство ЕЭС приняли ряд специальных документов, ограничивающих и далее запрещающих выпуск в окружающую среду ге­нетически модифицированных растений и других организмов.

В то же время в США, Великобритании, Франции, странах Восточной Европы приняты важные правительственные решения в поддержку био­технологии и биоинженерии, разрешающие использование генномоди­фицированных сортов и гибридов сельскохозяйственных культур. Среди активных противников биоинженерных модификаций, как правило, ученых почти нет. В большинстве своем это политики, предпри­ниматели, представители СМИ. Научно обоснованных, проверенных ар­гументов против создания и использования ГМО и полученных из них продуктов ими не выдвигаются. А на­званные ими факты о, якобы,  имевших место случаях нанесения ущерба здоровью людей или их гибели от использования генно-модифицированной пищи на поверку оказались не имеющими никакого отношения к трансгенным организмам.

Научно обоснованный прогноз событий вокруг проблемы трансге­нных организмов свидетельствует о том, что общественная волна протес­та в мире, в том числе и в России, уже достигает своего апогея и при стро­гом соблюдении всех требований законов и углубленном научном мони­торинге всего биоинженерного процесса в дальнейшем будет постепенно затухать.

По мнению специалистов-биотехнологов страны, которые искусст­венно выдвигают различные причины, задерживающие развитие биотех­нологии и биоинженерии и использование их достижений в производст­ве, в конечном итоге понесут значительный экономический урон, так как объем важнейшей биотехнологической и генно-инженерной продукции на мировом рынке будет постоянно возрастать, и они вынуждены будут тратить значительную часть своих валютных средств на покупку этих то­варов на мировом рынке.

     Контрольные вопросы: Назовите критерий, показатели и методы оценки генетически модифицированных организмов и получаемых из них продуктов на биобезопасность?  Какие работы проводятся в Республике Казахстан в рамках Картохенского Протокола?

                                                

 

МАТЕРИАЛЫ ЛЕКЦИЙ

ПО ДИСЦИПЛИНЕ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ БИОТЕХНОЛОГИИ В ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЕ И ЖИВОТНОВОДСТВЕ»

Лекция №1

Биотехнология: история, состояние и перспективы

Со второй половины ХХ века научный прогресс получает стремительное развитие. За этот период были созданы две технологии, коренным образом изменившие мир, в котором мы живем. Это - ядерная технология и электроника. За последние три десятилетия в нашу жизнь входит новая третья технология – современная биотехнология, основанная на открытиях в области микробиологии, иммунологии, биофизики, молекулярной биологии, генетики, биоорганической химии, а также таких наук как физика, химия и технология.

Корни биотехнологии уходят в далёкое прошлое и связаны с хлебопечением, виноделием и другими способами приготовления пищи, известными человеку еще в древности. Например, такой биотехнологический процесс, как брожение с участием микроорганизмов, был известен и широко применялся еще в древнем Вавилоне, о чем свидетельствует описание приготовления пива, дошедшее до нас в виде записи на дощечке, обнаруженной в 1981 г. при раскопках Вавилона. Историю становления биотехнологии условно подразделяют на пять основных периодов:

1. Допастеровский период (до 1865 г.). В этот период биотехноло­гическими методами получали пиво, вино, сыр, хлеб, йогурт, ке­фир, разного рода ферментированную пищу;

2. Пастеровский период (1865—1940 гг.). Стали известны микроор­ганизмы-продуценты, и это позволило создать производства этанола, бутанола, ацетона, глицерина, лимонной кислоты, многих вакцин, организовать процессы биологической очистки стоков аэробными микроорганизмами;

3. Период антибиотиков (1940—1960 гг.). Были открыты пени­циллин, стрептомицин и многие другие антибиотики, разработа­на технология культивирования клеток животных и получение вирусных вакцин, технология биотрансформации стероидных гормонов;

4. Период управляемого биосинтеза (1960—1975 гг.). Созданы техно­логии получения аминокислот, микробиологического белка на парафинах нефти, а также ферментов, используемых в стиральных порошках; внедрены в производство методы иммобилизации ферментов (закрепления их на носителях) для получения глюкозо-фруктозных сиропов; разработана технология анаэробной обработки твердых отходов с получением биогаза; открыт микробиологический спо­соб получения полисахаридов (начиная от ксантана для увеличе­ния вязкости раствора нефтяных скважин до жевательной резин­ки); начато использование микроорганизмов для получения витаминов В₃ и B₁₂, а также микопротеина — мицелиального микроскопического гри­ба, используемого как заменитель мяса; ученые научились куль­тивировать изолированные растительные клетки, что положило начало биотехнологическому производству многих ценных лекар­ственных веществ с использованием огромного потенциала лекар­ственных растений; создана основа биометаллургии — бактериального выщелачивания меди и цинка из руд; и др.;

5. Период современной биотехнологии (после 1975г.). Характеризуется разработкой генной инженерии, что позволило разработать микробиологическую технологию производства человечес­кого инсулина, интерферона, соматотропного и ростовых гормо­нов и многого другого; создана гибридомная технология производства моноклональных антител – мощного «инструмента» в разработке огромного раз­нообразия диагностических препаратов; появились, так называе­мые «трансгенные» растения и животные, в которых осуществля­лось целенаправленное конструирование генома; и др.

 По мере развития биотехнологии появлялись различные определения самого термина. Причем, до сегодняшнего дня нет четкого, всеобъемлющего определения науки «биотехнология». Наиболее удачным, на наш взгляд, является определение академика В.С.Шевелухи (2003). Он рассматривает биотехнологию, как науку, в двух временных и сущностных измерениях: современном и традиционном, т.е. классическом. Новейшая биотехнология, по определению академика, - это наука о генно-инженерных и клеточных методах и технологиях создания и использования генетически трансформированных (модифицированных) растений, животных и микроорганизмов в целях интенсификации производства и получения новых видов продуктов различного назначения. В традиционном, классическом смысле биотехнологию он определяет как науку о методах и технологиях производства, транспортировки, хранения и переработки сельскохозяйственной и другой продукции с использованием обычных, нетрансгенных (природных и селекционных) растений, животных и микроорганизмов, в естественных и искусственных условиях. Тем не менее, и эти определения не в полной мере отражают сущность как новейшей, так и классической биотехнологии. Во-первых, целью новейшей биотехнологии, в первую очередь, является достижение доступности для потребителей уже известных продуктов, а не «получение новых видов продуктов». Во-вторых, продуцентами полезных продуктов могут быть не только «растения, животные и микроорганизмы», но и изолированные растительные и животные клетки. Например, «мощное оружие» иммунологов – моноклональные антитела, синтезируются штаммами плазмоцитомы мыши, крысы и др. млекопитающих, получаемых методами клеточной инженерии. Судя по определению акад. В.С.Шевелухи, традиционной или классической биотехнологии можно отнести получение не только полезных метаболитов микроорганизмов, но и производство любой продукции животноводства или растениеводства. Ни один из вышеназванных периодов развития биотехнологии не имеет никакого отношения к технологиям производства молока, зерновых культур и др. сельскохозяйственных продуктов, за исключением ее современного периода. Однако, в данном случае речь идет об использовании продуктов трансгенных животных и растений. В литературе немало примеров, когда отдельные разработки в сфере растениеводства и животноводства представляются как биотехнологические. С этой точки зрения заслуживает внимание определение биотехнологии как целенаправленное получение ценных продуктов, в процессе которого используется биохимичес­кая деятельность микроорганизмов, изолированных клеток или их компонентов (Д.А.Васильев и соавт., 2005). Обосновывая это определение авторы пишут, что получение пшеницы из воды и удобрений на пер­вый взгляд — биотехнология. Однако здесь используется биохи­мическая деятельность не изолированных клеток, а целого расте­ния, макроорганизма, относящегося к высшим, многоклеточным организмам. Это, как справедливо подчеркивают авторы, — не биотехнология, а растениеводство. Точно так же получение лекарства из корня женьшеня — не биотехнология. А вот когда из этого корня берут отдельные клет­ки, отделяя их с помощью ферментов от многоклеточной расти­тельной ткани, и разводят эти отдельные, изолированные клетки на специальном питательном растворе, как дрожжи, получая биомас­су изолированных клеток женьшеня, из которой путем настаива­ния можно получить столь же ценное лекарство, как из целого корня, — это уже биотехнология.      Другой пример — производство молока. Молоко получают от коровы, овцы или другого млекопитающего животного, т. е. это — работа макроорганизма. Значит, это не биотехнология. А вот полу­чение из молока кефира, йогурта или другого кисломолочного продукта основано на биохимической деятельности молочнокислых бактерий — это вполне легитимная биотехнология. В производстве глюкозы из крахмала есть процесс гидролиза: раствор крахмала подкисляют, нагревают до определенной тем­пературы и выдерживают некоторое время. В результате крах­мал распадается на глюкозу, получается гидролизат — грязнова­тый раствор глюкозы с примесями. Это — химичес­кий, а не биотехнологический процесс. Есть другой процесс — процесс ферментативного гидролиза крахмала. В этом случае к суспензии крахмала добав­ляют фермент, и под его действием также происходит расщеп­ление крахмала до глюкозы, но в гораздо более мягких условиях и без образования нежелательных примесей, с меньшими поте­рями. Ферменты — это выделенные из клетки белковые веще­ства, компоненты клетки. Следовательно, по определению, этот процесс — биотехнология.

  Во всех приведенных примерах в качестве основания для отне­сения процесса к биотехнологии или к химической технологии мы рассматривали то, посредством каких воздействий осуществляется обработка продукта.

Иногда обращают внимание на другое: какое сырье обрабатыва­ется — химическое или биологическое. Например, очень часто производство мясных продуктов отно­сят к биотехнологии, обосновывая это тем, что исходное сырье — туши забитых животных, сырое мясо и так далее — являются про­дуктами биологического происхождения. С этой точки зрения, например, приготовление котлет — это биотехнология, хотя рабочий процесс заключается в измельче­нии мяса и затем в его тепловой обработке, т. е. нет биохимичес­кой деятельности микроорганизмов или клеток, а значит, это не биотехнология. А вот обработка мясного фарша определенными заквасками и последующий режим созревания, используемый при приготовлении дорогих сортов колбас, — это, конечно, био­технология.

Д.А.Васильев и соавт. (2005) также обращает внимание еще на одно важное слово в своем определении биотехнологии — «целенаправленно». Действительно, с точки зре­ния человека микроорганизмы работают в природе не всегда целе­направленно. Например, многие болезни вызываются действием микроорганизмов, и наоборот, многие микроорганизмы, населяю­щие человеческое тело, полезны. Вспомните, что после лечения антибиотиками, когда эти полезные микроорганизмы уничтожаются наряду с вредными, возникает та­кое заболевание, как дисбактериоз, которое приходится лечить вве­дением в организм бактерий (например, бифидобактерий или молочнокислых бактерий). Это не биотехнология, а медицина. Существует биогеохимическая деятельность бактерий, в ре­зультате чего происходит переработка растительности и деревьев в торф, уголь, нефть, выщелачивание металлов и многие другие гло­бальные процессы. Эти процессы нельзя называть биотехнологическими, потому что они нецеленаправленные. Или, например, можно заметить, как после загрязнения почвы нефтью происходит естественное (не организованное человеком, т. е. не целенаправ­ленное) биовосстановление — через 5-10 лет под воздействием микроорганизмов почва самоочищается. А вот когда мы специаль­но организовываем технологию очищения почвы, вводя в нее до­полнительные микроорганизмы или усиливая питание естествен­ных почвенных микроорганизмов, — это уже биотехнология, био­технология очистки почвы от загрязнений.

 В лекциях Д.А.Васильев и соавт. (2005) дано общее определение биотехнологии, без разделения ее на традиционную (классическую) и современную. Но оно справедливо лишь для биотехнологии прокариотных и эукариотных клеток, и не учитывает производство полезных веществ трансгенными макроорганизмами. Причем, не всегда ценные продукты образуются в результате «биохимической деятельности» клеток. Например, белки и гормоны, синтезируемые клетками, в том числе модифицированными, не относятся к продуктам их ферментативной активности. Обобщая вышеизложенное, биотехнологию следует определить как науку об использовании природных и модифицированных прокариотных и эукариотных клеток, а также трансгенных растений и животных для производства ценных продуктов.  

   Генная и клеточная инженерия - являются важнейшими методами (инструментами), лежащими в основе современной биотехнологии. Методы клеточной инженерии направлены на конструирование клеток нового типа. Они могут быть использованы для воссоздания жизнеспособной клетки из отдельных фрагментов разных клеток, для объединения целых клеток, принадлежавших различным видам с образованием клетки, несущей генетический материал обеих исходных клеток, и других операций.

Генно-инженерные     методы     направлены      на конструирование новых, не существующих в природе сочетаний генов. В результате применения генно-инженерных методов можно получать рекомбинантные (модифицированные) молекулы РНК и ДНК, для чего производится выделение отдельных генов (кодирующих нужный продукт), из клеток какого-либо организма. После проведения определенных манипуляций с этими генами осуществляется их введение в другие организмы (бактерии, дрожжи и млекопитающие), которые, получив новый ген (гены), будут способны синтезировать конечные продукты с измененными, в нужном человеку свойствами. Иными словами, генная инженерия позволяет получать заданные (желаемые) качества        изменяемых        или        генетически модифицированных организмов или так называемых «трансгенных» растений и животных. Наибольшее применение генная инженерия нашла в сельском хозяйстве и в медицине.

Люди всегда задумывались над тем, как можно научиться управлять природой, и искали способы получения, например, растений с улучшенными качествами: с высокой урожайностью, более крупными и вкусными плодами или с повышенной холодостойкостью. С давних времен основным методом, который использовался в этих целях, была селекция. Она широко применяется до настоящего времени и направлена на создание новых и улучшение уже существующих сортов культурных растений, пород домашних животных и штаммов микроорганизмов с ценными для человека признаками и свойствами.

Селекция строится на отборе животных (растений) с выраженными благоприятными признаками и дальнейшем скрещивании таких организмов, в то время как генная инженерия позволяет непосредственно вмешиваться в генетический аппарат клетки. Важно отметить, что в ходе традиционной селекции получить гибриды с искомой комбинацией полезных признаков весьма сложно, поскольку к потомству передаются очень большие фрагменты геномов каждого из родителей, в то время как генно-инженерные методы позволяют работать чаще всего с одним или несколькими генами. В результате, не теряя других полезных свойств растения, удается добавить еще один или несколько полезных признаков, что весьма ценно для создания новых сортов и новых форм растений. Стало возможным изменять у растений, например, устойчивость к климату и стрессам, или их чувствительность к насекомым или болезням, распространённым в определённых регионах, к засухе и т.д. Ведутся широкие исследования по улучшению пищевой ценности различных сельскохозяйственных культур, таких как кукуруза, соя, картофель, томаты, горох и др.

Исторически, выделяют «три волны» в создании генно-модифицированных растений. Первая волна (конец 1980-х годов) - создание растений с новыми свойствами устойчивости к вирусам, паразитам или гербицидам. В растениях «первой волны» дополнительно вводили всего один ген и заставляли его «работать», то есть синтезировать один дополнительный белок, «Полезные» гены «брали» либо у вирусов растений (для формирования устойчивости к данному вирусу), либо у почвенных бактерий (для формирования устойчивости к насекомым, гербицидам). Вторая волна (начало 2000-х годов) - создание растений с новыми потребительскими свойствами: масличные культуры с повышенным содержанием и измененным составом масел, фрукты и овощи с большим содержанием витаминов, более питательные зерновые и т.д. В наши дни ученые создают растения «третьей волны», которые в ближайшие годы появятся на рынке: растения-вакцины,       растения-биореакторы       для производства промышленных продуктов (компонентов для различных видов пластика, красителей, технических масел и т.д.), растения - фабрики лекарств и т.д.

Генно-инженерные работы в животноводстве имеют другую задачу. Вполне достижимой целью при современном уровне технологии является создание трансгенных животных с определённым целевым геном. Например, трансгенные козы, в результате введения соответствующего гена, могут вырабатывать специфический белок - фактор VIII, который препятствует кровотечению у больных, страдающих гемофилией,      или      фермент -      тромбокиназу, способствующий рассасыванию тромба в кровеносных сосудах, что актуально для профилактики и терапии тромбофлебита у людей. Трансгенные животные вырабатывают эти белки намного быстрее, а сам способ значительно дешевле традиционного.

Другим, не менее важным, направлением современной биотехнологии является “клеточная инженерия”, занимающаяся получением новых клеток с заданными свойствами путем слияния родительских клеток. В 1960 году французские ученые (Барски, Сорьель и Корнефор) установили, что при совместном культивировании двух линий опухолевых клеток мыши образуется новый тип клеток. Они отличались от родительских по морфологическим характеристикам и особенностям роста. Ядра новых клеток содержали число хромосом, являющееся суммарным числом хромосом родительских клеток. В нем также обнаруживали хромосомные маркеры родительских клеток. Позднее эти наблюдения получили свои подтверждения на нормальных клетках мыши. Эффективность слияния заметно возрастала в случае воздействия на родительские клетки японского гемагглютинирующего вируса (ЯГВ). Причем, Окаде и Тадокора (1962) доказали возможность использования вируса, полностью инактивированного ультрафиолетовыми лучами. В 1965 году Харис и Уоткинс для слияния клеток HeLa человека с опухолевыми клетками мыши использовали вирус Сендай, похожего на вирус ЯГВ. Позднее для получения соматических гибридов вместо вируса Сендай начал применяться полиэтиленгликоль. Причем была доказана возможность слияния клеток позвоночных, принадлежащих к различным отрядам, гибридизация растительных клеток разных видов и даже животных клеток с растительными.

Разработка методов слияния соматических клеток дала возможность исследователям искать новые пути решения актуальных проблем медицины, ветеринарии и сельского хозяйства. В частности появился новый подход в получении однородных (гомогенных) антител против возбудителей инфекционных болезней или других антигенов, имеющих большую диагностическую значимость. Метод получения однородных антител получил название гибридомной техники. Суть ее заключается в следующем. В организме на определенное чужеродное вещество (антиген) образуются защитные тела - антитела, неоднородные по своим физико-химическим и биологическим свойствам. Антитела продуцируются разными линиями В-лимфоцитов и направлены к различным участкам (детерминантам) антигена. Если бы одну клетку лимфоцита можно было выделить и растить in vitro, то полученный клон вырабатывал бы один тип антител - моноклональные антитела. Однако, лимфоциты не могут расти вне организма. В то же время существуют злокачественные опухоли - миеломы, клетки которых продуцируют большое количество аномальных иммуноглобулинов. Они способны к неограниченному росту и синтезируют иммуноглобулины сходные по всем параметрам. Таким образом, исследования по получению клеток-гибридов, способных вырабатывать моноклональные антитела в условиях in vitro имели теоретическую основу. В конце 1974 года Келеру и Милстейну удалось получить гибридому путем слияния клеток миеломы и лимфоцитов из селезенки мыши, иммунизированной эритроцитами барана. Они сумели изолировать клоны клеток, продуцирующие определенный тип молекул антител и расти в питательной среде вне организма. Клетки-химеры, названные гибридомами, наследовали способность к неограниченому росту в культуре и одновременно вырабатывать антитела идентичной специфичности, т.е. моноклональные антитела. Последние становятся мощным инструментом в разработке высокоэффективных методов диагностики и лечения болезней.   

Другой из методов клеточной инженерии - клонирование находит свое применение в животноводстве. Клонирование – это способ получения идентичных потомков при помощи бесполого размножения. Иначе клонирование можно определить как процесс воспроизводства генетически идентичных копий отдельного организма. В природе клонирование широко распространено у различных организмов. У растений естественное клонирование происходит при различных способах вегетативного размножения, у животных - при партеногенезе и различных формах полиэмбрионии (полиэмбриония: от «поли-» и греч. embrion - «зародыш» - образование у животных нескольких зародышей (близнецов) из одной зиготы в результате ее неправильного деления вследствие воздействия случайных факторов). У людей примером полиэмбрионии может служить рождение однояйцевых близнецов, которые являются естественными клонами. Широко распространено клональное размножение среди ракообразных и насекомых.

Первым искусственно клонированным многоклеточным организмом стала в 1997 г. овца Долли. Сутью техники «ядерного переноса», используемой при клонировании, является замена собственного клеточного ядра оплодотворенной яйцеклетки на ядро, извлеченное из клетки организма, точную генетическую копию которого планируется получить. К настоящему времени разработаны не только методы воспроизведения того организма, из которого клетка была взята, но и того, от которого был взят генетический материал. Появилась потенциальная возможность воспроизведения умершего организма, даже в том случае, когда от него остались минимальные части - необходимо только, чтобы из них можно было выделить ДНК.

  Клонирование открывает новые перспективы в сельском хозяйстве и животноводстве. Путём клонирования можно получать животных с высокой продуктивностью яиц, молока, шерсти или таких животных, которые выделяют нужные человеку ферменты (инсулин, интерферон и др.). Комбинируя методы генной инженерии с клонированием, можно вывести трансгенные сельскохозяйственные растения, которые смогут сами себя защищать от вредителей или будут устойчивы к определённым болезням. Здесь были перечислены только некоторые из возможностей, которые открываются, благодаря применению этой новейшей технологии. Однако, при всех своих достоинствах и перспективах, столь важных для решения многих проблем человечества, клонирование является одной из самых обсуждаемых областей науки и медицинской практики. Это связано с нерешенностью целого комплекса морально-этических и правовых аспектов, связанных с манипуляциями с половыми и стволовыми клетками, судьбой эмбриона и клонированием человека.

    Клонирование организмов может быть полным или частичным. При полном клонировании воссоздаётся весь организм целиком, а при частичном - воссоздаются лишь те или иные ткани организма. Технология воссоздания целого организма крайне перспективна в случае необходимости сохранения редких видов животных или для восстановления исчезнувших видов. Частичное клонирование - может стать важнейшим направлением в медицине, поскольку клонированные ткани могут компенсировать недостаток и дефекты собственных тканей организма человека и, что особенно существенно, они не отторгаются при трансплантации. Такое терапевтическое клонирование изначально не предполагает получение целого организма. Его развитие сознательно останавливают на ранних стадиях, а получившиеся     клетки,     которые        называются эмбриональные стволовые клетки (эмбриональные или зародышевые стволовые клетки - самые примитивные клетки, возникающие на ранних стадиях развития эмбриона, способные развиться во все клетки взрослого организма), используют для выработки нужных тканей или других биологических продуктов. Экспериментально доказано, что терапевтическое клонирование может быть также с успехом применено для лечения некоторых заболеваний человека, до сих пор считающихся неизлечимыми (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, инфаркт, инсульт, диабет, рак, лейкемия и др.), позволит избежать рождения детей с синдромом Дауна и другими генетическими заболеваниями. Ученые видят возможность успешного использования методов клонирования в борьбе со старением и для увеличения продолжительности жизни. Важнейшим приложением этой технологии является и область репродукции - при бесплодии, как женском, так и мужском. Массовое внедрение в медицинскую практику и коммерциализация принципиально новых технологий в области генной инженерии и клонирования, привело также к необходимости создания соответствующей правовой базы, регулирующей все юридические аспекты деятельности в этих направлениях. Современная биотехнология создает огромные возможности вмешательства в жизнедеятельность живых организмов и неизбежно ставят человека перед нравственным вопросом: до какого предела допустимо вторжение в природные процессы? Практика, существующая в современных демократических обществах, показывает, что эти дискуссии абсолютно необходимы не только для более полного понимания всех «плюсов» и «минусов» применения методов, вторгающихся в личную жизнь человека уже на уровне генетики. Они позволяют также обсудить морально-этические аспекты и определить отдаленные последствия применения биотехнологий, что, в свою очередь, помогает законодателям создавать адекватную правовую базу, регулирующую данную сферу деятельности в интересах защиты прав личности.

Остановимся на тех направлениях в биотехнологических исследованиях, которые напрямую связаны с высоким риском нарушения прав личности и вызывают наиболее острую дискуссию по поводу их широкого применения: пересадка органов и клеток в терапевтических целях и клонирование. В последние годы резко возрос интерес к изучению и применению в биомедицине эмбриональных стволовых клеток человека и техники клонирования с целью их получения. Как известно, эмбриональные стволовые клетки способны трансформироваться в разные типы клеток и тканей (кроветворные, половые, мышечные, нервные и др.). Они оказались перспективными для применения в генной терапии, трансплантологии, гематологии, ветеринарии, фармакотоксикологии, при тестировании лекарств и пр.

Выделение этих клеток производят из эмбрионов и плодов человека 5-8 недель развития, полученных при медицинском прерывании беременности (в результате аборта), что порождает многочисленные вопросы относительно этической и юридической правомерности проведения исследований на эмбрионах человека. Все эти вопросы решались бы гораздо проще, если бы существовало универсальное понимание, что такое «начало жизни», с какого момента можно говорить о «личности, нуждающейся в защите прав» и что подлежит защите: половые клетки человека, эмбрион с момента оплодотворения, плод с какого-то определенного этапа внутриутробного развития или человек с момента его появления на свет? У каждого из вариантов есть свои сторонники и противники, и вопрос о статусе половых клеток и эмбриона не нашел своего окончательного решения еще ни в одной стране мира.

В ряде стран запрещены любые исследования на эмбрионах (например, в Австрии, Германии). Во Франции права эмбриона защищаются с момента его зачатия. В Великобритании, Канаде и Австралии, хотя создание эмбрионов для исследовательских целей не запрещено, но разработана система законодательных актов, регулирующая и контролирующая подобные исследования. Ученые стараются четко разграничивать "репродуктивное" клонирование, цель которого - создание клона, то есть целого живого организма, идентичного другому организму по генотипу, и "терапевтическое" клонирование, применяемое для выращивания колонии стволовых

 

клеток. В случае стволовых клеток проблемы статуса эмбриона и клонирования приобретают новое измерение. Это связано с мотивацией данного рода научных исследований, а именно применение их для поиска новых, более эффективных способов лечения тяжелых и даже неизлечимых заболеваний. Поэтому в некоторых странах (США, Канада, Англия), где до последнего времени считалось недопустимым использовать эмбрионы и технологии клонирования в терапевтических целях, происходит изменение позиции общества и государства в сторону допустимости их применения в целях лечения таких заболеваний, как рассеянного склероза, болезней Альцгеймера и Паркинсона, постмиокардиального инфаркта, недостаточности регенерации костной или хрящевой ткани, при черепно-лицевых травмах, диабете, миодистрофии и др.

В то же время терапевтическое клонирование многими рассматривается как первый шаг к репродуктивному клонированию, которое встречает крайне негативное отношение во всем мире, и на него повсеместно наложен запрет. Клонирование человека в настоящее время официально нигде не осуществляется. Опасность в его применении в репродуктивных целях видят в том, что техника клонирования исключает естественное и свободное слияние генетического материала отца и матери, что воспринимается как вызов достоинству человека. Нередко говорится о проблемах самоидентификации клона: кого он должен считать родителями, почему он является генетической копией кого-то другого? Кроме того, клонирование сталкивается с некоторыми техническими препятствиями, которые подвергают опасности здоровье и благополучие клона. Есть факты, свидетельствующие о быстром старении клонов, возникновении у них многочисленных мутаций. В соответствии с техникой клонирования, клон вырастает из взрослой - не половой, а соматической клетки, в генетической структуре которой на протяжении многих лет происходили так называемые соматические мутации. Если при естественном оплодотворении мутировавшие гены одного родителя компенсируются нормальными аналогами другого родителя, то при клонировании такой компенсации не происходит, что значительно увеличивает для клона риск заболеваний, вызываемых соматическими мутациями, и многих тяжелых заболеваний (рака, артрита, иммунодефицитов). Помимо прочего, у некоторых людей возникает страх перед клонированным человеком, перед его возможным превосходством в физическом, моральном и духовном развитии.

В лекции приведены только некоторые из многочисленных проблем, которые возникают в связи с бурным развитием биотехнологий и вторжением их в жизнь человека. Безусловно, прогресс науки остановить нельзя и вопросы, которые она ставит, возникают быстрее, чем общество может на них найти ответы. Справиться с этим положением дел можно лишь понимая, насколько важно широко обсуждать в обществе этические и правовые проблемы, которые появляются по мере развития и внедрения в практику биотехнологий. Наличие колоссальных идеологических расхождений по этим вопросам вызывает осознанную необходимость серьезного государственного регулирования в этой сфере.

Предлагаемая дисциплина рассматривает современные проблемы ветеринарной медицины и животноводства (иммуно- и генодиагностика, новое поколение вакцин, производство лекарственных и кормовых препаратов, создание трансгенных животных, эмбриоинженерия, биотехнология и безопасность), которые решаются и впредь могут быть успешно решены с использованием методов современной биотехнологии.

     Контрольные вопросы: 1.Перечислите основные периоды развития биотехнологии; 2. Дайте определения классической и современной биотехнологии; 3.Назовите направления современной биотехнологии; 4. Какие задачи ставят перед собой генетическая инженерия в сфере животноводства? 5. Перспективные задачи клеточной инженерии в ветеринарии и животноводстве. 

 

Лекция №2