Для исследования влияния внешних факторов на динамику роста и развития микроорганизмов, а также для культур, продуцирующих суммарный продукт жизнедеятельности микроорганизмов с максимальной липолитической и минимальной протеолитической активностью провели скриннинговое исследование.

Для этого культивирование проводили в колбах Эрленмейера объемом 250 см³, содержащей 200 мл бактериальной суспензии на основе жидкой синтетической среды Рана (п.2.2.8). Количество вводимой биомассы 10⁵ кл/см³ на 200 см³ рабочей жидкости. Культивирование микроорганизмов проводили в термостате при температуре (37±5)°С, осуществляя переменное механическое воздействие на встряхивателе «Shaker Type-357», с частотой колебаний 200 об/мин, амплитудой 6 по 2 ч в сутки в течение 48 часов. Для изучения динамики активности микроорганизмов через каждые 24 часа снимали такие показания, как подсчет величины КОЕ (п.2.2.9), мутность (п.2.2.10), кислотность (п.2.2.11), активная реакция среды (п.2.2.16) после 48 часов культивирования был определен суммарный продукт жизнедеятельности микроорганизмов (п.2.2.12). Кроме того, определяли показатели для контрольной среды – не зараженной культурами микроорганизмов.

Для определения липолитической и протеолитической активностей эндофермента бактериальную суспензию после 48 часов культивирования подвергали центрифугированию при 5000 об./мин. в течение 15 минут. Осадок, образующийся в результате центрифугирования замораживали, после чего растирали в фарфоровой ступке со стеклом, добавив 100 см³ дистиллированной воды. Полученную суспензию центрифугировали при 5000 об./мин. 10 минут для удаления стекла. После того как, стекло удалили в полученную жидкость вводили 30% от объема (NH₄)₂SO₄ для высаливания белка и центрифугировали при 5000 об./мин. в течение 15 минут, после чего на стенках центрифужной пробирки образовывался желтый налет, который собирали в колбу Эрленмейера объемом 100 см³ и приливали 30 см³ дистиллированной воды, тщательно перемешивали и и отбирали пробы для определения липолитических, протеолитических свойств (п.2.2.13, 2.2.14) и суммарного продукта жизнедеятельности микроорганизмов.

Для определения липолитических и протеолитических свойств экзофермента в над осадочную жидкость полученную после первого центрифугирования при определении свойств эндофермента вводили 30% от объема (NH₄)₂SO₄ для высаливания белка, и проводили все операции аналогично как при определении активностей эндофермента.

Протеолитическую активность определяли по методу Вильштеттера и Вальдшмидта-Лейтца (п.2.2.13) и рассчитывали по формулам (2) и (3).

Пример расчета протеолитической активности для культуры Н:

а = 1,4 мл.; а_к = 1,29 мл.

А = (1,4-1,29) × 1,4 × 1 = 0,154 мг.

0,154 × 12 × 100

ПС =                                 = 3,08 ед. на 1 г. культуры.

3 × 1 × 2 × 10

Липолитическую активность определяли по модифицированному методу Ота, Ямада (п.2.2.14) и рассчитывали по формуле (4).

Пример расчета липолитической активности для культуры Н:

В = 46,3 г/см³; А = 0,25 см³.

0,25 × 2 × 50

ЛС =                                  = 0,54 ед./г.

46,3

Дальнейшие расчеты проводили аналогичным образом. Результаты, полученные после проведения скриннинговых исследований, представлены в таблице 4.

Таблица 4 – Результаты проведения скриннинговых исследований

Полученные результаты показывают, что для всех культур, за исключением культур 3 и 8, характерен рост кислотности к 48 часам культивирования, что связано с вовлечением жирового материала в конструктивный и энергетический обмен микроорганизмами. В результате метаболических процессов наблюдается деструкция жирового материала до глицерина и карбоновых кислот, в результате образования которых повышается кислотность среды. К примеру, кислотность среды, содержащей культуру Н возрастает с 1,26 г/дм³ до 1,56 г/дм³, что соответствует наиболее максимальному возрастанию кислотности по сравнению с остальными средами. Наименьшая интенсивность возрастания данного показателя отмечена для сред, содержащих культуру Нв - увеличение с 1,2 г/дм³ до 1,26 г/дм³.

Оптическая плотность определяли на фотоколориметре ФЭК-4 при длине волны 540 нм, чувствительности 2 и толщине поглощающего слоя 3,025 мм. При изучении динамики изменения значений мутности можно отметить, что для бактериальных суспензий культур Н и 8 характерен рост данного показателя в течение 48 часов культивирования, связанный с наступлением для культур микроорганизмов благоприятной для их бурного развития лог-фазы. Наибольшее увеличение значения мутности характерно для среды, содержащей культуру 8. К 48 часам культивирования наблюдался рост мутности с 4,0 до 5,8, что связано с интенсивным вовлечением природных жировых веществ в клеточный метаболизм. Уменьшение значения мутности наблюдалось у бактериальных суспензий культур Нв, В и 3. Данная динамика может объясняться процессами автолиза, в частности возрастанием лимитирования по субстрату и образованием альдегидов

Изменение рН рабочей жидкости проводили на цифровом иономере Анион 7000. Из данных таблицы видно, что уменьшение рН наблюдалось только для среды, содержащей культуру 8, что вероятно связано с деструкцией жира и образованием глицерина и карбоновых кислот, обуславливающих кислую реакцию среды.

О                                                          O

//                                                           //

СН₂ – О – С                                         R₁ – C

\                                                            \                 

R₁                   CH₂ – OH                 OH

ê            О                    ç                               O

//            CH – OH + //

СН – О – С ® ç                      R₂ – C

     \                               CH₂ – OH                \

R₂                                                         OH

ê            O                                                          O

//                                                           //

CH₂ – O – C                                                  R₃ – C

\                                                            \

R₃                                                         OH

В течение 48 часов вероятно происходит расщепление карбоновых кислот микроорганизмами до соответствующих альдегидов, которые окисляются до кислот или полимеризуются. В результате чего значение рН через 48 часов увеличилось для сред, содержащих культуры Н, Нв, В и 3.

O                    O

//                     //

R – C ® R – C

\                       \

OH                  H

Также наблюдался устойчивый рост величины КОЕ в течение всего периода культивирования с 10⁵ по 10⁶ кл/см³, что указывает на достаточное количество субстрата в синтетической среде и его утилизации.

На основании проведения скриннинговых исследований можно отметить, что все исследуемые культуры осуществляют деструкцию жирового материала. Деструкция жирового материала на первом этапе возможно происходит до глицерина и карбоновых кислот, это подтверждается увеличением значений кислотности в первые часы культивирования. В результате проведения предварительного скрининга и изучения морфолого-культуральных признаков исследуемых прокариотических организмов были отобраны наиболее активные культуры для проведения дальнейших исследований. Интерес представляла культура 8, характеризующаяся максимальным ростом оптической плотности среды до 48 часов культивирования и культура Нв с наибольшим значением липолитической активности. Для выбранных культур провели скриннинговое исследование через 24ч и 48часов по которому сделали подбор оптимального времени культивирования. Результаты представлены в таблице 5 и на рисунках 4-6.

Таблица 5 – Подбор оптимального времени культивирования

При анализе таблицы можно сделать вывод, что при достижении необходимого объема бактериальной суспензии значительных изменений в показаниях не происходило. Вероятно, это говорит о том, что система стабилизирована.

Рисунок 4 – Динамика изменения активной реакции среды для сред, содержащих культуры 8 и Нв

Рисунок 5 – Динамика изменения кислотности для сред, содержащих культуры 8 и Нв

Для показателя кислотности бактериальных суспензий характерно увеличение к 24 часам культивирования для сред, содержащих культуры Нв и 8, с дальнейшим уменьшением значения кислотности для среды, содержащей культуру Нв, обусловленное, возможно полным расщеплением субстрата, в качестве которого выступал нерпичий жир и расщепление образовавшихся карбоновых кислот до альдегидов, либо одноатомных спиртов. Для среды, содержащей культуру 8 наблюдалось увеличение кислотности до 48 часов культивирования, что связано с ее меньшей активностью.

Рисунок 6 – Динамика изменения оптической плотности для культур 8 и Нв

При рассмотрении динамики изменения оптической плотности можно отметить увеличение данного показателя для обеих культур, что связано с интенсивным вовлечением природных жировых веществ в клеточный метаболизм. А в дальнейшем, в связи с автолитическими процессами, наиболее важным из которых является лимитирование по субстрату, наступает так называемая фаза отмирания микроорганизмов, что влечет за собой уменьшение показаний мутности к 48 часам культивирования.

Рисунок 7 – Диаграмма зависимости протеолитической и липолитической активностей суммарного продукта жизнедеятельности микроорганизмов от продолжительности культивирования

При анализе протеолитической и липолитической активностей можно сделать вывод, что минимальной протеолитической активностью обладает суммарный продукт жизнедеятельности культуры Нв, а максимальной липолитической активностью обладает суммарный продукт жизнедеятельности культуры 8 через 24 часа культивирования. Следовательно, в подготовительных процессах выделки, а именно в обезжиривании будет использована культура 8.