С целью восстановления свойств микроорганизмов в жидкие питательные среды объемом 150 см³ на основе мясопептонного бульона (МПБ) и синтетической среды Рана, в которой в качестве источника углерода служил нерпичий жир (п.2.2.1), внесли исследуемые культуры в количестве 10⁵ кл/ см³ (петлей). Культивирование проводили в колбах Эрленмейера объемом 250 см³ в термостате марки «ТС-80М-2» при температуре (37±0,5)˚С в течение 24 часов в состоянии покоя. После истечения заданного времени культивирования перенесли 0,1 мл. бактериальной суспензии и произвели посев на соответствующие плотные среды в чашки Петри.

Для исследования морфолого-культуральных свойств прокариотических организмов была восстановлена культура микроорганизмов методом штриха и разведений (п.п.2.2.2-2.2.3) на мясопептонном агаре (МПА) и на синтетической среде Рана. Культивирование проводили в перевернутых чашках Петри в термостате при температуре (37±0,5)˚С в течение 24 часов для МПА и 48 часов для среды Рана.

Выделенные культуры были обозначены следующим образом: Нв – микроорганизмы, выделенные из жира нерпы, но адаптированные к росту на шерстном жире; Н – микроорганизмы, выделенные из жира нерпы; В – выделенные из шерстного жира; 3, 8 – культуры микроорганизмов, выделенные из сточных вод после проведения процесса обезжиривания меховой овчины.

При рассмотрении характера роста культур на разных средах можно отметить, что колонии микроорганизмов, выращенных на мясопептонном агаре, характеризуются более значительными размерами, по сравнению с культурами, выращенными на синтетической среде Рана, что обусловлено повышенной чувствительностью культур к агрессивной среде, содержащей в качестве единственного источника углерода нерпичий жир, в количестве 1 г/дм³.

Исследование морфолого-культуральных свойств, выделенных колоний микроорганизмов проводили по следующим параметрам: окрашиванию по методам Грама, Трухильо и Леффлеру (п.2.2.4), определение подвижности методом раздавленной капли (п.2.2.6) и определение культуральных свойств (п. 2.2.5).

Результаты исследования морфолого-культуральных свойств бактерий представлены в таблице 3 и на рисунках А1-А5.

Таблица 3 – Сравнительная таблица морфолого-культуральных признаков исследуемых культур

Окрашивание мазков показало, что все культуры являются грамположительными мелкими палочками, аспорогенными с перетрихиальным расположением жгутиков. Более подробно форму бактерий можно рассмотреть на рисунках 2-6, полученных в результате фотографирования окрашенных мазков на микроскопе Ломо Микмед–1 с помощью цифрового фотоаппарата «Samsung». По форме бактерий культуры типа Н, Нв и В следует отнести к коккобактериям – мелким палочкам, близким к овальной форме, в то время как культуры типа 8, 3 представляют собой бактерии, диплобактерии и стрептобактерии. Размер исследуемых микроорганизмов варьируется в пределах 0,1-0,5 нм.

При рассмотрении раздавленной капли бактериальной суспензии было отмечено броуновское движение бактерий, сопровождающееся вращательным движением, обусловленным перетрихиальным расположением жгутиков.

Результаты изучения культуральных свойств представлены на рисунках А6-А10. При изучении культуральных свойств установлено, что все культуры имеют точечные колонии матового цвета, непрозрачные, с ровными краями.

Для определения липолитической активности был произведен посев в бульон Штерна, содержащего в качестве субстрата глицерин. Посев производили следующим образом: для получения биомассы исследуемой культуры микроорганизмов производили посев на скошенную синтетическую среду и культивировали в течение 24 часов при температуре (37±0,5)˚С, затем произвели смыв полученной биомассы 10 см³ бульона Штерна в пробирки, и термостатировали при температуре (37±0,5)˚С в течение 120 часов в термостате марки «ТС-80М-2».

При рассмотрении поведения культур в данной среде выявлено, что уже к 24-48 часам культивирования имело место переход окраски бульона из розового в ярко – красный (рисунок А11), образование хлопьевидного осадка и газообразование. К 72 часам культивирования наблюдалось появление биопленки и пристеночного кольца, а к 96 часам посветление сред до светло-розового цвета. При рассмотрении окраски по столбу жидкости была отмечена ее дифференсация: окраска была более интенсивной в верхней части жидкости, что возможно обусловлено более высоким содержанием кислорода в этом слое. Следовательно, для роста данных микроорганизмов необходим кислород.

Также было отмечено изменение активной реакции среды (рН=7 контрольной пробы). Через 24 часа культивирования после заражения бульона Штерна при температуре (37±0,5)˚С произошло понижение рН с 5 до 3 для всех исследуемых сред за исключением сред, содержащих культуру 8, активная реакция которой сохранялась в течение 72 часов и составляла рН=4, а к 120 часам культивирования повысилась до рН=5. Для остальных культур было характерно плавное повышение активной реакции среды до рН=5 к окончанию культивирования (120 часов).

На основе проведенных исследований следует отметить, что исследуемые культуры микроорганизмов обладают липолитической активностью, т.е. вовлекают вещества жировой природы (в качестве источника углерода) в конструктивный и энергетический обмен, что заметно по таким показателям среды как: появление хлопьевидного осадка, изменение цвета от восстановления индикатора при изменении рН. Однако выявления культуры с чётко выраженной максимальной величиной активности по липазе не было – наблюдается одинаково равнозначные характеристики роста на специализированной среде в течение всего периода культивирования.