В течение 60-х исследователи обратились к естественному эффективному поставщику кислорода – гемоглобину. Это белок красных кровяных клеток, который обеспечивает поступление кислорода из воздуха к тканям и углекислого газа – от тканей в воздух. Молекула гемоглобина состоит из двух молекул альфа-протеина и двух молекул бета-протеина. Если гемоглобин покидает защитную среду эритроцита, его молекула распадается на субъединицы, которые могут вызвать повреждения почек. Исследователи попробовали стабилизировать гемоглобин перекрестным связыванием альфа- и бета-субъединиц и соединением отдельных молекул гемоглобина с получением гемоглобинового полимера. Уже много раз казалось, что вот-вот будет создан газотранспортный гемоглобиновый кровезаменитель, но возникали новые проблемы, которые отбрасывали исследователей на исходные позиции. «Причин тому несколько, - объясняет Сергей Воробьев, старший научный сотрудник Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН. – Сами по себе молекулы гемоглобина нельзя запустить в кровяное русло. Гемоглобин мгновенно будет связан белками плазмы, например, альбумином, превратится в гаптоглобин и будет утилизирован в почках, костном мозге и селезенке. Этот процесс может привести к гемоглобинурии (лихорадка, головные боли, боли в мышцах и суставах) и, хуже того, вызвать тромбоз сосудов».

Поскольку в крови гемоглобин находится внутри эритроцитов, естественно, появилась идея заключить его в «мешок» - микрокапсулу. Четверть века пытаются, смешивая фосфолипиды, холестерин, яичный лецитин, сделать оболочку капсулы. Опыты на животных показали, что такие искусственные клетки выживают в кровотоке лишь несколько часов. Иммунная система организма разрушает их и удаляет остатки из системы кровообращения, при этом возникает сильная аллергическая реакция. Кроме того, гемоглобин в искусственной оболочке работает неэффективно. Он присоединяет кислород в легких, но очень плохо отдает его в капиллярах кровотока.

Подобные трудности побудили разработчиков искусственной красной крови отказаться от микрокапсул и попытаться использовать свободный гемоглобин, но сшить его отдельные молекулы химическими методами, создав полигемоглобиновые кристаллы. Преимущество такого подхода в том, что полигемоглобиновые комплексы могут циркулировать в крови, не будучи распознаваемы иммунной системой. Хотя внутри эритроцита гемоглобин образует различные виды кристаллических упаковок, сами по себе эти упаковки очень хрупкие и вне эритроцита мгновенно разваливаются от небольших перепадов температуры или колебаний рН-среды. Чтобы сделать полигемоглобиновую упаковку устойчивой, ее сшивают глутаровым альдегидом или диимидоэфирами. Однако при этом, наряду с межмолекулярными, неизбежно возникают и внутримолекулярные сшивки, которые ограничивают подвижность частей молекулярной машины и существенно снижают ее газотранспортные способности. Кроме того, межмолекулярные сшивки могут изменять равновесные состояния между аминогруппами деталей белковой машины и ограничивать движение доменов внутри молекулы. Вот и приходится создателям гемоглобиновых кровезаменителей метаться меж двух огней: сильно сошьешь молекулы – ликвидируешь газотранспорт, слабо соединишь гемоглобины – они развалятся в кровотоке и приведут к тромбообразованию.

В 1990-х медицинская корпорация Baxter заняла лидерство в гонке за появление на рынке препаратов для кислородной терапии, сделанные на основе гемоглобина. К 1998 году на третью стадию клинических испытаний поступил ГемАссист – раствор, содержащий связанный гемоглобин. Компания Baxter создала этот продукт для помощи пациентам, которые потеряли много крови. Однако когда медики проанализировали данные по 100 пострадавшим от огнестрельных или колотых ранений и жертвам автомобильных аварий, выяснилось, что пациенты, которые применяли ГемАссист, умирали чаще, чем те, кто получал натуральную кровь. Этого оказалось достаточно для того, чтобы В axter приостановила испытания и прекратила выпуск препарата.

К середине 2003 года исследователи уже провели десятки испытаний на животных и клинические испытания препаратов для кислородной терапии на основе гемоглобина. Но до сих пор Управление по контролю за пищевыми продуктами и лекарствами США (FDA) не разрешило эти препараты для лечения людей. Почему это длится так долго? Доктор Абду Элайш из Центра биологических исследований FDA объясняет: «Доклинические и клинические испытания препаратов выявили общие для них побочные эффекты (имеется в виду повышение кровяного давления, нарушение работы желудочно-кишечного тракта, панкреатит и поражения нервной системы).Поскольку в начале производства доклинические и клинические испытания на здоровых добровольцах проводились успешно, мало внимания было уделено механизму работы молекулы гемоглобина в новых условиях (то есть вне красных клеток крови),не говоря о влиянии химических и генетических манипуляций с молекулой гемоглобина». ГемАссист не выдержал клинических тестов, что подтверждает точку зрения доктора Элайша о том, что вне клетки молекула гемоглобина может повести себя совершенно неожиданно. Тем не менее, американские компании продолжают исследования по поиску новых гемоглобиновых средств для кислородной терапии.

Три компании пошли по пути создания препаратов на основе гемоглобина из донорской крови, которая превысила срок хранения. Для изготовления Гемоспана (Hemospan) компания Sangart Inc . (Сан-Диего, Калифорния) обезвредила изолированный гемоглобин, обработав белки полиэтиленгликолем. Как утверждает компания, при добавлении полиэтиленгликоля образуется слой воды, который окружает белок. Этот водяной слой защищает белок о атаки иммунной системы, увеличивает эффективный размер молекулы гемоглобина и продлевает время его циркуляции. Sangart в конце 2003 года начала вторую стадию клинических испытаний в Швеции. Испытания искусственной крови, которая может вливаться пациенту независимо от его группы крови, проводились в двух больницах Стокгольма — Южной и Каролинской. В испытаниях Hemospan приняли участие 8 пациентов. По словам профессора медицины Бенгта Фаргелля, испытания нового американского заменителя крови Hemospan в Швеции дали хорошие результаты. Явными преимуществами препарата, заменяющего кровь, является его совместимость с любой группой крови, малый риск заражения и длительный срок хранения. Недостаток Hemospan, по словам Бенгта Фаргелля, в том, что проводимость кислорода этим заменителем крови сокращается практически в два раза за первые двое суток. Именно по этой причине искусственная кровь может применяться лишь в неотложной ситуации.

Northfield Laboratories Inc.(Эвангстон, Иллинойс) и компания Hemosol Inc. (Миссиссуага, Онтарио, Канада) полимеризовали человеческий гемоглобин для придания ему стабильности.

В июне 2003 года лаборатория Northfield объявила, что компания достигла соглашения с FDA на проведение третей стадии клинических испытаний пиридоксилированного полимеризированного гемоглобина под названием ПолиГем. Polyheme – гемоглобин-кислородный носитель, как единственный кровезаменитель, завершивший фазу третьего клинического испытания, представляет собой ведущую технологию в этой области. Разработанный и произведенный в Чикаго основавшее Polyheme первоначально готовился как военный проект после Вьетнамской войны и показал большой потенциал как для военного так и гражданского использования. Извлечение и фильтрация гемоглобина из красных кровяных телец - первый шаг в производстве. Затем, используя многоступенчатый процесс полимеризации, очищенный гемоглобин связывается в тетрамеры и, как конечный шаг, включается в раствор электролита. Полимеризация гемоглобина - критический шаг этого процесса, поскольку, как было продемонстрировано в неудачных попытках замен крови, когда гемоглобин разобщен, он стремится принять оксид азота, что вызывает сужение сосудов. Также, свободный гемоглобин может быть принят почками, вызывая различные нарушения работы органов. Недавно Northfield Laboratories изучала испытания третей стадии клинических испытаний, в которых они прошли свыше 20 циклов в центрах травматологии по всей стране. Дискуссия возникает из-за того, что участники этого анализа неспособны дать согласия из-за природы их повреждений. Хотя эта практика санкционирована Федеральным Управлением Лекарственных Препаратов И Продуктов Питания как необходимое непредвиденное исследование, общества защиты прав пациентов начали протестовать против анализа.

Компания Hemosol обработала гемоглобин о-раффинозой для производства гемолинка – полимерного гемоглобина. Хотя компания довела до конца последнюю стадию клинических испытаний, производство было остановлено в апреле 2003 года, поскольку принимавшие его пациенты испытывали побочные эффекты. Четыре месяца спустя компания объявила что препарат будет дополнительно исследован на животных. Пока препарат находится на второй стадии клинических испытаний.

Тем временем компания Baxter пыталась получить препараты, переносящие кислород,на основе гемоглобина, в том числе применила технологию с использованием рекомбинатной ДНК. В тот год, когда Baxter отказалась от своего кислородного препарата первого поколении, она приобрела компанию Somatogem Inc .,которая работала над молекулой рекомбинатного гемоглобина. Тогда и Baxter сосредоточила силы на разработке рекомбинатного гемоглобина бактериального происхождения. Но 17 июля 2003 года компания объявила о своем решении не продолжать первую фазу клинических испытаний рекомбинантного гемоглобина, потому что кислородный препарат оказался неэффективным.

Технология с использованием рекомбинатной ДНК позволяла избегать зависимости от поставок донорской крови как источника гемоглобина. Корпорация Biopure, нынешний лидер в торговле кислородными препаратами, для того чтобы не зависеть от поставок донорской крови, решила получать свою продукцию из бычьей крови. Оксиглобин – это полимезированный бычий гемоглобин, продукт, который Biopure продает как ветеринарный препарат. FDA и Европейская комиссия разрешили использовать это кислородное соединение для лечения анемии у собак. Ветеринарный продукт Biopure's Oxyglobin(R) [hemoglobin glutamer - 200 (бычий)], или HBOC-301, единственный кислородный терапевтический препарат, одобренный США. Biopure продала приблизительно 180,000 препаратов Oxyglobin. Biopure также выпустила гемопьюр – гемоглобин, молекулы которого претерпели поперечную сшивку. Заменитель состоит из гемоглобина, выделенного из крови животных и прошедшего очистку при помощи многократной фильтрации и хроматографии под высоким давлением. Biopure завершила третью стадию клинических испытаний и обратилась в FDA за разрешением продавать гемопьюр в США пациентам с острой анемией, перенесшим ортопедические операции. Новый заменитель прошел 20 циклов успешных клинических испытаний в Америке и Европе. Представители Biopure уверены в безопасности продукта. Южно-Африканская Республика стала первым в мире государством, одобрившим раствор, который может быть использован в качестве заменителя крови при переливании. Препарат гемопьюр является универсальным средством, которое можно вводить пациентам с любым типом крови. В отличие от донорской крови, которая в обязательном порядке должна быть заморожена и может храниться не более 42 суток, гемопьюр возможно хранить при комнатной температуре в течение двух лет. Южноафриканский Совет по медицинскому контролю одобрил решение об использовании Hemopure(R) [hemoglobin glutamer - 250 (бычий)], или HBOC-201 при лечении острой анемии, возникающей у пациентов, которым проведена хирургическая операция. Этот препарат создан на основе коровьего гемоглобина, причем в технологии его изготовления использованы все новейшие достижения микробиологии, позволяющие с уверенностью заявить, что в данном случае полностью исключен риск заражения человека заболеваниями крупного рогатого скота, в том числе коровьим бешенством. Исключен риск и заражения ВИЧ.

Ученые из нескольких европейских государств намерены в течение трех лет с помощью грибов и бактерий создать универсальный заменитель крови. Пока в проекте Euro Blood Substitutes участвуют 12 институтов, а координационный центр находится в Ноттингэмском университете. Цель нового проекта — сделать переливание более безопасным, поскольку использование донорской крови связано с высокими рисками, в частности, из-за повсеместного распространения СПИДа. Исследования начнут с двух микроорганизмов, которые биоинженеры уже применяют для производства лекарств — гриба Aspergillus niger и бактерии Escherichia coli. С их помощью планируется синтезировать белки, схожие с гемоглобином, которые будут способны переносить кислород между легкими и нуждающимися в нем органами. Основная сложность эксперимента заключается в том, что человеческий организм обычно «отторгает» чужие биомолекулы. «Новую кровь», в отличие от естественной, можно будет стерилизовать. Именно это, по мнению ученых, позволяет рассчитывать на популярность будущего препарата в Восточной Европе и в Африке, где отмечены частые случаи заражения СПИДом при переливании донорской крови. Кроме того, таким образом, Euro Blood Substitutes собирается привлечь новые инвестиции и общественное внимание к европейским биотехнологиям.

Использование не донорской, а иной крови помогло и одной европейской компании при производстве кислородных препаратов. «СангуБиоТех» (Виттен, Германия) получила свиной гемоглобин поперечной сшивкой с глутаральдегидом, в результате чего образовались гигантские полимерные структуры кровяного белка. В среднем эти гиперполимеры содержат по 10 связанных молекул гемоглобина. Продукт компании находится на стадии доклинических испытаний.