Подученный биологический материал необходимо сразу же поместить одновременно на селективную и неселективную питательную среду, поскольку некоторые штаммы гонококков чувствительны к концентрациям ванкомицина и триметоприма, входящих в состав селективной среды.

Культивирование гонококков следует проводить на чашках Петри диаметром 90 мм с количеством среды не менее 20 мл на чашку или 100 мм с количеством среды 26 мл. После приготовления чашек со средой они ставятся в термостат при 36±1°С на 1 час для удаления конденсата (излишней влажности). Пересушивание среды недопустимо, т.к. это отразится на качестве роста гонококков. Перед проведением посева чашки необходимо прогреть в термостате при температуре +36±1°С в течение 30 минут.

Клинический материал от каждого пациента должен засеваться на отдельную чашку Петри. При использовании больших чашек (90 или 100 мм) материал из уретры и цервикального канала у женщин может засеваться на одну чашку Петри в разные ее секторы с соответствующей маркировкой. Материал из уретры мужчин должен засеваться на отдельную чашку.

Взятый материал тампоном наносится на поверхность. Затем стерильной бактериологической петлей материал распределяется по площади поверхности питательной среды штриховыми движениями в 3 - 4 разных на правлениях с целью создания условий для роста отдельно расположенных колоний гонококков. Чашки немедленно помещаются в анаэростат с содержанием СО₂ 5±2%. влажностью 70%, который ставится в термостат с контролируемой температурой 36±1⁰С. Допускается использование эксикатора, который ставится в термостат с контролируемой температурой 36±1⁰С, в эксикаторе создаются условия повышенного содержания СО₂ при помощи свечении газогенерирующих пакетов и влажности. Чашки просматриваются через 18 - 24 часа инкубации, в случае отсутствия роста - через 48 часов:

· При отсутствии признаков роста через 72 часа инкубации наблюдение прекращают.

· При выявлении характерных колоний проводится первичная и видовая идентификация.

B. Идентификация нейссерии

Первичная идентификация нейссерии проводится путем:

· визуальной оценки вида колоний,

· окраски материала подозрительных колоний по Граму;

· оксидазного теста.

· Оценка вида колоний

Типичные колонии гонококков через 18 - 24 часа инкубации выпуклые прозрачные серо-белого цвета, имеют диаметр 0,5 - 1,0 мм. При дальнейшей инкубации колонии могут увеличиваться в размерах до 3,0 мм и уплощаться. Нередко на одной чашке можно встретить колонии разного вида.

Большие трудности возникают при идеитификации колоний гонококка в посевах из ротоглотки, т.к. при этом часто вырастают менингококки и непатогенные нейссерии, колонии которых сходны с колониями гонококков. Колонии менингококка выглядят голубоватыми, колонии непатогенных нейссерии - беловатыми, а гонококков - бесцветными, слизистыми. Размер, цвет, морфология и консистенция колоний могут варьировать в зависимости от применяемой питательной среды. Идентифицировать возбудителя можно только при определении сахаролитических свойств культур или другими тестами, подтверждающими видовую принадлежность микроорганизма.

· Применение оксидазного теста

Обнаружение оксидазоположительных грамотрицательных диплококков считается достаточным для их идентификации как N. gonorrhoeae при рутинной диагностике. Для определения цитохром-с оксидазы можно использовать один из рекомендованных методов:

· На подозрительную колонию наносится капля оксидазного реагента {тетраметилфенилендиамина, 1%-ный водный раствор). Быстрое изменение цвета реагента, в течение 5 - 10 секунд, на сине-фиолетовый и его сохранение дольше 30 секунд позволяет считать тест положительным. Реагент, используемый в оксидазном тесте, убивает гонококки, поэтому дальнейшая работа с этими колониями будет невозможна.

· Полоска фильтровальной бумаги смачивается несколькими каплями реагента, затем на нее помещается бактериологической петлей материал из подозрительной колонии. Этот способ позволяет сохранить материал на чашке для проведения дальнейших исследований. Высокая чувствительность оксидазного теста не согласуется с его специфичностыо. Оксидазоположительными могут быть и другие бактерии, выделяющие цитохромную оксидазу, поэтому оксидазоположнтельные колонии микроорганизмов обязательно нужно исследовать микроскопически с окраской по Граму.

· Имеются коммерческие диски и полоски, содержащие диметил-р-фенилендиамина гидрохлорид. Платиновой петлей или стерильной стеклянной палочкой испытуемую культуру наносят на диск, предварительно слегка смоченный дистиллированной водой.

Учет результата

Темно-лиловое или синее окрашивание, появляющееся через 10 - 30 секунд, свидетельствует о положительной оксидазной реакции. Отсутствие изменения цвета - об отсутствии данного фермента.

При исследовании мазков, окрашенных по Граму, из культур учитываются морфология, расположение и окраска гонококков. После 18 - 24 часов культивирования гонококки представляют собой скопления грамотрицательных кокков и диплококков, имеющих более компактное расположение микроорганизмов в центре и разреженное и неравномерное распределение по периферии.

Наряду с интенсивно окрашенными в розово-красный цвет кокками встречаются и бледно-окрашенные формы. Более старые культуры (48 часов и более) трудно интерпретировать, т.к. отмечается большое количество полностью лизированных клеток. По мере старения культуры увеличивается полиморфность гонококков.

Для подтверждающей идентификации нейссерий используются тесты:

· изучение ферментативной активности;

· иммунологические тесты (прямая иммунофлюоресценция, коагглютинация);

· молекулярно-биологические методы (ПЦР).