Все большее значение приобретают специфические серологические реакции РИФ и РИБТ.

Принцип РИФ основан на выявлении флюоресцирующих антител, так как меченные флюорохромом антитела не теряют способности соединяться с соответствующим антигеном и тем самым обусловливают свечение препаратов в сине-фиолетовых лучах, источником которых является ртутно-кварцевая лампа.

Отличительной чертой РИФ, по сравнению со стандартными серореакциями, является более высокая чувствительность (поэтому она бывает положительной у ряда больных в первичном серонегативном периоде сифилиса) при сохранении высокой специфичности. Однако, РИФ уступает по специфичности РИБТ, хотя по технике постановки она значительно проще.

Реакция ставится в нескольких модификациях: РИФ-ц, РИФ-200 и РИФ-абс. Считается, что РИФ-ц более чувствительна, а РИФ-200 и РИФ-абс – более специфичны.

Реакция ставится непрямым методом в 2 фазы. В первой фазе реакции на антиген наносится испытуемая сыворотка крови. Если в ней имеются соответствующие антитела, то образуется комплекс антиген – антитело. Для выявления образовавшегося комплекса проводится вторая фаза реакции, при которой его обрабатывают меченной флюорохромом иммунной кроличьей сывороткой (против сывороточных глобулинов человека)

Полученный во второй фазе комплекс антиген-антитело определяется с помощью люминесцентной микроскопии. Если свечения антигена нет, то это указывает на отсутствие в испытуемой сыворотке крови соответствующих антигену антител.

Наиболее ценной модификацией РИФ является РИФ-200, основным назначением которой считается не ранняя серодиагностика сифилиса, а распознавание неспецифических результатов КСР и серодиагностика других форм сифилитической инфекции, в том числе и скрытого сифилиса. При установлении излеченности сифилиса решающим является отрицательный результат РИФ-200. не обладает абсолютной специфичностью, поэтому вопрос о наличии или отсутствии заболевания должен решаться на основании совокупности клинических, серологических и других данных.

Техника постановки РИФ-200. Из антигена готовят препараты на тонких, обезжиренных предметных стеклах, на обратной стороне которых обозначены кружки диаметром 1 см. Антиген в пределах кружка, и высушенный на воздухе мазок фиксируют в течение 5 мин в чистом ацетоне. После фиксации стекла помещают во влажную камеру. Инактивированные испытуемые сыворотки крови разводят в 200 раз изотоническим раствором натрия хлорида. Для проведения первой фазы реакции на помещенные во влажную камеру препараты наносят испытуемые сыворотки. После этого влажную камеру закрывают и помещают в термостат при +35°С на 30 мин. По истечении этого времени препараты вынимают из влажной камеры, промывают в течение 10 мин в двух порциях изотонического раствора натрия хлорида и помешают в штатив для высушивания. После высушивания препараты вновь помещают во влажную камеру и наносят по капле разведенной по титру флюоресцирующей сыворотки против глобулинов человека. Вторую фазу реакции проводят при комнатной температуре, после чего препараты 10 мин промывают в изотоническом растворе натрия хлорида, высушивают и монтируют для люминесцентной микроскопии. Монтирование препаратов заключается в том, что на них стеклянной палочкой наносят маленькие капли забуференного глицерина, накрывают их тонкими, обезжиренными предметными стеклами, на которые стеклянной палочкой наносят по капле нелюминесцирующее иммерсионное масло. Исследование препаратов производят в люминесцентном микроскопе. Степень свечения трепонем, зависящая от количества антител в сыворотке крови, обозначается плюсами. Свечение считается положительным, если его оценивают как 4+, 3+ и 2+.

E. Реакция иммунофлюоресценции-абсорбции с БТ (FTA‑ABS)

Используемый для реакции антиген представляет собой взвесь бледных трепонем из пораженных сифилисом яичек кролика, фиксированную ацетоном на предметном стекле. Можно также использовать лиофилизированные бледные трепонемы после их восстановления в изотоническом растворе натрия хлорида. Инактивированную сыворотку инкубируют с сорбентом для абсорбирования неспецифических групповых антител. Затем сыворотку помещают пипеткой на антиген, находящийся на предметном стекле. Специфические антитела связываются бледными трепонемами. После промывания к трепонемам на предметном стекле добавляют комплекс античеловеческого глобулина с флюоресцентным красителем. Этот комплекс связывается с человеческим глобулином на оболочке клеток бледных трепонем и может быть идентифицирован методом флюоресцентной микроскопии. По прошествии не менее 2 ч по степени флюоресценции сыворотку можно классифицировать как нереактоспособную, пограничную или реактоспособную. Реакция, обозначаемая двумя плюсами или больше, свидетельствует об инфекции.

Появления реактоспособности можно ожидать примерно в начале 3-й недели после заражения, а у нелеченных больных она обнаруживается постоянно. Сыворотка остается реактоспособной и через несколько лет после успешного лечения раннего сифлиса, а у больных, получивших адекватное лечение при позднем сифилисе, – на протяжении десятилетий.

Главными достоинствами реакции FTA‑ABS являются:

· высокая специфичность и чувствительность,

· быстро наступающая реактоспособность.

Положительная FTA‑ABS может иметь решающее значение для диагностики в сомнительных случаях, особенно при положительных реакциях VDRL или автоматизированной реакции микрогемагглютинации (АМНА‑ТР), используемых для скрининга.

F. Реакция 19S IgM-FTA-ABS

При идентификации антител IgM к бледным трепонемам реакцией FTA‑ABS с использованием конъюгата анти-IgM в качестве реагента выявлялись ложноположительные и ложноотрицательные результаты. Реакция 19S IgM-FTA-ABS в этом отношении является наиболее точным, специфичным методом. В целях отделения крупных молекул 19S IgM от более мелких молекул 7S IgM используется методика ультрацентрифугирования, адсорбирования на белке А и гель-фильтрация с применением ультрагеля АсА 34 с трисбуфером при рН 8,0 на колонке К 26/100 при объеме геля 300 мл, скорости потока 27 мл/ч и +24⁰С. В этой системе первый пик элюата содержит фракцию 19S IgM. В процессе фильтрования отделяются непрочные иммунные комплексы. Использование фракции 19S IgM в реакции FTA-ABS обеспечивает высокую специфичность, устраняя возможность неспецифических, ошибочных результатов.