4.4.1 Описание технологической схемы стадии <номер и название стадии по заданию>

Целью данной стадии является получение маточной культуры дрожжей для засева в аппарат ЧК-I.

На засев аппарата ЧК-I идёт две колбы маточной культуры, по 5 л в каждой. Все сведения о количестве сырья и полупродуктов приводятся для получения 1 колбы маточной культуры (V_{мат.к-ры}=5 л).

Стадия состоит из нескольких операций:

1. Приготовление питательных сред

Для выращивания маточной культуры используются две жидкие питательные среды разного состава.

Первая питательная среда (с солодовым экстрактом) используется на начальных стадиях культивирования чистой культуры в лаборатории – I и II стадиях.

Она состоит из следующих компонентов (из расчёта на 50 мл питательной среды):

- солодовый экстракт (ρ= , СВ=13, рН=4,5) – 50 мл;

- (NH₄)₂SO₄ – 0,17 г;

- (NH₄)₂HPO₄ – 0,34 г;

- MgSO₄ – 0,08 г.

50 мл солодового экстракта отмеряют с помощью мерного цилиндра объёмом 50 мл. Соли отвешивают на настольных лабораторных весах.

Компоненты вручную смешивают в лабораторной посуде подходящего объёма, с помощью рН-метра измеряют рН и, при необходимости добавляя концентрированные кислоты или основания, устанавливают рН=4,5. После чего переносят полученную смесь в колбу объёмом 100 мл.

Вторая питательная среда (с солодовым экстрактом и мелассой) используется на конечных стадиях выращивания чистой культуры в лаборатории – на III и IV стадиях.

Она состоит из следующих компонентов (из расчёта на 4950 мл питательной среды):

- солодовый экстракт (ρ= , СВ=13, рН=4,5) – 2475 мл;

- меласса (ρ=1092,2 кг/м³) – 2475 мл;

- (NH₄)₂SO₄ – 16,34 г;

- (NH₄)₂HPO₄ – 33,22 г;

- MgSO₄ – 8,25 г.

2475 мл солодового экстракта и 2475 мл мелассы отмеряют с помощью мерных цилиндров объёмом 2000 мл. Соли отвешивают на настольных лабораторных весах.

Компоненты вручную смешивают в лабораторной посуде подходящего объёма, с помощью рН-метра измеряют рН и, при необходимости добавляя концентрированные кислоты или основания, устанавливают рН=4,5. После чего переносят полученную смесь в колбу объёмом 6000 мл.

Колбы закрывают ватно-марлевыми пробками, которые накрываются сверху бумажными колпачками. На колбы с питательными средами наклеивают химические индикаторные бумажки, по которым определяют эффективность проведённой стерилизации, и относят их на стерилизацию.

2. Стерилизация питательных сред

Питательные среды стерилизуют в автоклаве. Для каждой из них свой режим вследствие разницы в составе, а как следствие, и в начальном количестве микроорганизмов, содержащихся в среде. Контроль эффективности стерилизации осуществляют не только по манометру и химическим индикаторным бумажкам, но и с помощью штамма тест-микроорганизма – Geobacillus stearothermophilus (на стадии образования спор).

Питательную среду с солодовым экстрактом стерилизуют под давлением насыщенного водяного пара р=0,2 МПа (t=120⁰C) в течение 25 минут.

Питательную среду с солодовым экстрактом и мелассой стерилизуют под давлением насыщенного водяного пара р=0,2 МПа (t=120⁰C) в течение 50 минут.

По прошествии заданного времени необходимо выждать, пока давление в автоклаве выровняется с атмосферным, после этого колбы можно вынимать. Стерильным питательным средам дают остыть, прежде чем засевать в них чистую культуру дрожжей. Также до засева необходимо убедиться в том, что режим стерилизации был соблюдён и питательные среды действительно стерильны.

3. Получение маточной культуры дрожжей. I стадия.

Колбу с остывшей стерильной питательной средой с солодовым экстрактом (V_ПС=50 мл) переносят на стол, расположенный рядом с микробиологическим боксом.

Засев осуществляется в микробиологическом боксе. Все действия в боксе осуществляет микробиолог, переодетый в соответствующую технологическую одежду. Работа с питательной средой и культурой микроорганизмов проводится в асептических условиях.

В заранее подготовленный микробиологический бокс переносят колбу с питательной средой с солодовым экстрактом. Поверхность стола и руки обрабатывают тампоном, смоченным этиловым спиртом 70%, зажигают спиртовую горелку. В зоне горящей спиртовой горелки из колбы с питательной средой с помощью стерильной мерной пипетки отмеряют 5 мл и переносят их в стерильную пробирку на 10 мл, после чего последнюю закрывают ватно-марлевой пробкой и помещают в штатив.

В одну руку берут микробиологическую петлю, обжигают её в пламени горелки, в другую руку берут пробирку с чистой культурой дрожжей на скошенном агаре, открывают пробку, обжигают горлышко пробирки в пламени, захватывают петлёй биомассу, после чего пробирку закрывают пробкой и ставят в штатив. Открывают пробирку с 5 мл питательной среды, обжигают её горлышко в пламени горелки и вносят в неё биомассу на петле, после чего пробирку закрывают пробкой и помещают в штатив, а петлю обжигают в пламени и ставят в стакан. После того как произведён засев, горелку гасят.

Пробирку с питательной средой и засеянной чистой культурой выращивают в термостате при температуре t=30 ⁰С в течение 3 ч без аэрации. Оставшуюся в колбе питательную среду (V_ПС=45 мл) помещают в холодильник.

4. Получение маточной культуры дрожжей. II стадия.

По прошествии времени культивирования I стадии (3 ч) пробирку с полученной культуральной жидкостью I стадии (V_кжI=5 мл) вынимают из термостата и переносят в заранее подготовленный микробиологический бокс. Туда же переносят колбу с оставшейся питательной средой с солодовым экстрактом (V_ПС=45 мл), которую за 30-40 минут до засева достают из холодильника и оставляют при комнатной температуре.

Поверхность стола и руки обрабатывают тампоном, смоченным этиловым спиртом 70%, зажигают спиртовую горелку. Из штатива берут пробирку с культуральной жидкостью I стадии, снимают пробку, обжигают горлышко пробирки в пламени горелки, открывают колбу с питательной средой, обжигают её горлышко в пламени, переливают содержимое пробирки в колбу и закрывают последнюю пробкой. Спиртовую горелку гасят.

Колбу, содержащую питательную среду и культуральную жидкость I стадии, помещают в термостат (t=30 ⁰C) на 24 ч. Культивирование проходит без аэрации.

5. Получение маточной культуры дрожжей. III стадия.

Колбу с остывшей стерильной питательной средой с солодовым экстрактом и мелассой (V_ПС=4950 мл) переносят на стол, расположенный рядом с микробиологическим боксом.

По прошествии времени культивирования II стадии (24 ч) колбу с полученной культуральной жидкостью II стадии (V_кжII=50 мл) вынимают из термостата и переносят в заранее подготовленный микробиологический бокс. Туда же переносят и колбу с питательной средой.

Поверхность стола и руки обрабатывают тампоном, смоченным этиловым спиртом 70%, зажигают спиртовую горелку. В зоне горящей спиртовой горелки открывают колбу с питательной средой, отливают из неё в стерильный мерный цилиндр объёмом 500 мл 450 мл питательной среды, колбу закрывают. Снимают пробку со стерильной колбы объёмом 1000 мл, обжигают в пламени горелки её горлышко, переносят в неё содержимое мерного цилиндра. Открывают колбу с культуральной жидкостью II стадии, обжигают её горлышко в пламени горелки, переливают содержимое в колбу объёмом 1000 мл с питательной средой, закрывают последнюю пробкой. Спиртовую горелку гасят.

Колбу, содержащую питательную среду и культуральную жидкость II стадии помещают в термостат (t=30 ⁰C) на 22 ч. Культивирование проходит без аэрации. Оставшуюся в колбе питательную среду с солодовым экстрактом и мелассой (V_ПС=4500 мл) помещают в холодильник.

6. Получение маточной культуры дрожжей. IV стадия.

По прошествии времени культивирования III стадии (22 ч) пробирку с полученной культуральной жидкостью III стадии (V_кжIII=500 мл) вынимают из термостата и переносят в заранее подготовленный микробиологический бокс. Туда же переносят колбу с оставшейся питательной средой с солодовым экстрактом и мелассой (V_ПС=4500 мл), которую за 1,5-2 ч до засева достают из холодильника и оставляют при комнатной температуре.

Поверхность стола и руки обрабатывают тампоном, смоченным этиловым спиртом 70%, зажигают спиртовую горелку. В зоне горящей спиртовой горелки с колбы с культуральной жидкостью III стадии снимают пробку, обжигают горлышко колбы в пламени горелки, снимают пробку с колбы с питательной средой, переливают культуральную жидкость в неё и закрывают пробкой. Спиртовую горелку гасят.

Колбу, содержащую питательную среду и культуральную жидкость III стадии помещают в термостат (t=30 ⁰C) на 20 ч. Культивирование проходит без аэрации.

По прошествии заданного времени колбу с маточной культурой (V_{мат.к-ры}=5000 мл) вынимают из термостата и относят в производственный цех для засева аппарата ЧК-I.

4.4.2 Описание технологической схемы стадии <номер и название стадии по заданию>