7.4.1 Подготовка к процедуре выщелачивания отходов

При подготовке проб необходимо пользоваться средствами индивидуальной защиты: специальной одеждой по ГОСТ 12.4.103-83, полихлорвиниловыми перчатками по ГОСТ 12.4.013-85, респираторами, головными уборами.

Вся посуда перед использованием тщательно моется и обрабатывается 10 %-ным раствором азотной кислоты, затем промывается водопроводной водой и ополаскивается 3 - 4 раза дистиллированной водой. Для мытья посуды не разрешается пользоваться синтетическими поверхностно-активными веществами и органическими растворителями. Посуду для отбора проб сушат на воздухе, а химическую, за исключением мерной, - в сушильном шкафу при (105 ± 5) °С. Химически чистая посуда должна храниться с закрытыми стеклянными притертыми пробками или завинчивающимися крышками в защищенных от пыли ящиках лабораторного стола или на закрытых полках, стеллажах и т.п.

7.4.2 Пробоподготовка перед выщелачиванием

Экстракт выщелачивания готовится из соотношения твердая фаза: жидкость: - 1:10. В качестве жидкости используется

дистиллированная вода. Объем/масса обрабатываемых проб: жидких отходов и шламов - не менее 2 дм³, твердых отходов - 5 кг. Пробы следует оберегать от изменения их состава на всех стадиях пробоподготовки и хранения. Пробы должны храниться при температуре не более 4 °С и анализироваться как можно быстрее после отбора. Хранение проб более 5 суток не допускается.

Твердые отходы

Проба (5 кг) тщательно перемешивается перекатыванием на гладкой, гибкой и плотной подстилке, затем совком. Общий объем отобранной пробы делится на представительные половины, одна из частей возвращается в сосуд для хранения, оставшаяся часть (2,5 кг) пробы осматривается и разрыхляется. В случае обнаружения частиц более 10 мм они осторожно измельчаются с помощью пестика или шпателя до достижения размера менее 10 мм. Недопустимо размалывать смесь. Затем проба высушивается до воздушно-сухого состояния в открытом виде в течение двух часов при комнатной температуре и влажности воздуха. В пробе проводится определение содержания влаги. Затем проба сокращается методом квартования: тщательно перемешанную пробу разравнивают на гладкой поверхности на клеенке или полиэтиленовой пленке и с помощью линейки или специальной решетки делят на равные квадраты. Затем из квадратов в шахматном порядке отбирают порции, обеспечивая захват всей толщины слоя, и объединяют их. Максимальная сухая масса представительной пробы должна составлять 50 г. Затем рассчитывается масса пробы, подвергаемой выщелачиванию, с учетом влажности. Чтобы обеспечить необходимые 50 г сухой массы, обычно требуется 50 - 100 г пробы первоначальной влажности. Проба взвешивается в сосуде для выщелачивания с погрешностью ±1 г, в рабочем журнале записывается масса и содержание влаги. После выщелачивания 50 г пробы будет получено приблизительно 450 см³ водной вытяжки, с учетом этого следует рассчитывать общее необходимое минимальное количество отбираемой порции в результате сокращения пробы.

Если этот объем вытяжки недостаточен для проведения необходимых химических анализов и/или проведения биотестирования во всех предполагаемых разведениях с учетом контрольных испытаний, масса пробы на стадии подготовки к выщелачиванию должна быть увеличена.

Шламы

Шламы с большим содержанием твердой фазы, не разделяющиеся самостоятельно, обрабатываются также как твердые. Отдельно определяется содержание влаги и масса шлама, эквивалентная 50 ± 1 г в пересчете на сухую массу.

Шламы с большим содержанием жидкости обрабатываются следующим образом: жидкость фильтруется через вакуум фильтр (0,45 микрон) и отбирается 50 - 100 г твердого осадка. Если такого количества пробы недостаточно для получения 50 г твердого вещества, собирается столько, сколько необходимо. При необходимости отбор проб повторяют и отбирают большее количество пробы.

Твердый осадок доводится до воздушно-сухого состояния, в нем определяется содержание влаги и потеря массы. В результате этой процедуры получается твердый осадок, который взвешивается (±1 г) и переносится в сосуд для выщелачивания. В рабочем журнале регистрируется масса остатка и содержание влаги в нем.

Производится процедура выщелачивания.

Если полученный объем вытяжки недостаточен для проведения необходимых химических анализов и/или проведения биотестирования во всех предполагаемых разведениях с учетом контрольных испытаний, масса пробы на стадии подготовки к выщелачиванию должна быть соответственно увеличена.

Жидкие отходы

Жидкие отходы и отходы, содержащие менее 1 % взвешенного материала, не подвергаются выщелачиванию, а фильтруются через фильтр «синяя лента». Фильтрат подвергается анализу и/или биотестированию.

7.4.3 Выполнение процедуры получения экстракта выщелачивания

В сосуд для выщелачивания, где находится сухая масса отхода весом 50 ± 1 г, добавляется дистиллированная вода. Вода добавляется в сосуд для выщелачивания в соотношении сухая масса: жидкость - 1:10.

Объем воды измеряется мерной посудой.

Смесь должна слабо перемешиваться на мешалке в течение 7 - 8 часов. Недопустимо измельчение частиц отходов при перемешивании. Используется большая лопасть механической мешалки или большая магнитная мешалка, а скорость перемешивания должна быть наименьшей, при которой материал поддерживается во взвешенном состоянии.

После окончания перемешивания раствор с осадком оставляют на ночь (12 - 18 час). Если жидкость после отстаивания становится прозрачной, фильтрование не требуется. Если имеется видимый взвешенный материал, жидкость должна быть профильтрована. Фильтрование осуществляется с помощью вакуумного насоса через фильтр «синяя лента» на воронке Бюхнера. При этом применяется слабый вакуум (приблизительно 20 мм рт.ст.). Во избежание дегазации фильтрата насос должен быть выключен немедленно после прохождения всей жидкости через фильтр. Факт фильтрования отмечается в рабочем журнале.

Процедуру биотестирования необходимо начать не позднее, чем через 6 час после отстаивания экстракта Если это невозможно, допускается хранение экстракта в холодильнике не более 48 час при температуре 4 °С.

Перед биотестированием необходимо измерить pH и температуру полученного экстракта. Данные регистрируются в журнале.

Если отход был разделен на жидкую и твердую фракции, результаты исследования жидкой фракции и экстракта выщелачивания из твердой фракции должны быть указаны в отчете отдельно.

Если одна из этих частей была признана опасной, опасным признается и весь отход.

Подготовка тест-системы « Эколюм » и прибора «Биотокс-10»

7.5.1 Реконструкция тест-системы « Эколюм ».

7.5.1.1 Вскрыть флакон с лиофилизированным биореагентом. Добавить 10 см³ дистиллированной воды (комнатная температура, pH 6,8 - 7,4) - получают суспензию бактерий. В случае необходимости pH дистиллированной воды доводят до нужного диапазона подщелачиванием 10 %-ным раствором NaOH или подкислением 10 %-ным раствором НСl. При отсутствии такой воды или её плохого качества можно использовать стандартный физиологический раствор. Рекомендуется несколько раз встряхнуть флакон с суспензией бактерий.

При отсутствии дистиллированной воды или её плохого качества можно использовать стандартный физиологический раствор. В таком случае во вскрытый флакон добавляют 10 см³ физиологического раствора. Вытяжку из объектов делают физиологическим раствором или в измеряемую пробу добавляют 0,9 % по объему соли NaCl.

При исследовании морской воды в дистиллированную воду, предназначенную для регидротации бактерий, добавляют соль NaCl в концентрации, характерной для исследуемой акватории. Далее проводят анализ по стандартной схеме.

В случае использования морских люминесцентных бактерий во флакон с реагентом «Эколюм» добавляют 3 % NaCl в дистиллированной воде. Все дальнейшие разбавления бактериальной суспензии проводят этим раствором. Экстракцию водной вытяжки из объектов окружающей среды проводят 3 % NaCl в дистиллированной воде. В жидкие пробы добавляют NaCl до содержания 3 %.

7.5.1.2 Выдержать суспензию в течение 30 минут, периодически перемешивая.

7.5.13 Держать флакон с суспензий бактерий можно на лабораторном столе при нормальном освещении. Рекомендуется перемешивание суспензии бактерий перед каждым отбором определенных объемов для проведения анализа.

7.5.2 Подготовку прибора «Биотокс-10» проводят в соответствии с инструкцией по эксплуатации.

7.5.3 Определение рабочей концентрации тест-системы «Эколюм».

7.53.1 Измерить фоновое значение прибора «Биотокс-10» (по инструкции к прибору, при счете 10 сек без кюветы) и записать это значение.

7.5.3.2 Добавить 0,1 см³ суспензии бактерий из флакона в кювету люминометра. Затем туда же добавить 0,9 см³ дистиллированной воды (pH 6,8 - 7,4; комнатная температура).

7.5.3.3 Вставить кювету с биореагентом в люминометр и измерить величину интенсивности биолюминесценции за 10 сек.

7.5.3.4 Рекомендуется, чтобы свечение суспензии бактерий находилось в интервале, превышающем фоновое значение прибора в 100 - 500 раз. Если величина свечения намного больше верхнего предела, то рекомендуется разбавить суспензию бактерий дистиллированной водой и повторить измерение.

ПРОЦЕДУРА БИОТЕСТИРОВАНИЯ

8.1 Определение индекса токсичности

При определении индекса токсичности необходимо проводить параллельное измерение контрольных (не содержащих токсических веществ) и опытных проб. Рекомендуется иметь по три образца контрольных и опытных проб. Для большей достоверности данных число параллельных измерений опытной пробы может быть увеличено до 10 измерений. Измеряют контрольную пробу, и прибор запоминает измеренную величину. Затем измеряются повторности опытной пробы, и прибор автоматически фиксирует значения индекса токсичности каждой пробы, норматив сходимости индекса токсичности и погрешности измерения.

8.1.1 Измерение интенсивности биолюминесценции и индекса токсичности проводят с помощью прибора «Биотокс-10» согласно инструкции по эксплуатации прибора.

8.1.2 При стандартном анализе отбирают из флакона по 0,1 см³ рабочей суспензии бактерий и добавляют в три кюветы от люминометра -контрольные и в три кюветы для пробы. Добавляют в контрольные кюветы по 0,9 см³ дистиллированной воды (pH 6,8 - 7,4). Добавляют в остальные кюветы опытную пробу по 0,9 см³ и замечают время экспозиции и через 30 минут начинают биотестирование. Попарно измеряют интенсивность свечения бактерий в кюветах с контролем и опытом, записывают показания прибора по индексу токсичности. После измерения третьей кюветы с опытной пробой, кроме того, записывают показания прибора по средней токсичности из трех измерений образца и погрешности измерения.

В случае если исследуются образцы почвы, взятые с локально загрязненных территорий (п. 7.3.1), в контрольную кювету вместо дистиллированной воды вносят экстракт из фоновых почв и добавляют рабочую суспензию бактерий.

8.1.3 Рабочую суспензию бактериальной тест-системы «Эколюм» используют в течение 8 часов после её приготовления, хранить её можно при комнатной температуре.

8.2 Определение токсикологических параметров пробы, ЕС20 и ЕС50, и параметров предельно допустимых сливов

Эта операция предназначена для быстрого выяснения вопроса, при каких объемах исходного слабо токсического образца достигаются установленные пределы токсичности (Т = 50 и/или Т = 20) или при каких разведениях сильно токсический образец (ЕС больше 50) станет безопасным (величины менее ЕС20), а также при расчете нормативов предельно допустимых сбросов сточных вод.

8.2.1 Рекомендуется перед измерением коэффициентов ЕС убедиться при измерении токсичности (п. 8.1) неразбавленной пробы, что величина G для данной пробы не превышает значения 25. В случае если величина G больше, может увеличиться погрешность измерения величин ЕС. В таком случае необходимо развести пробу дистиллированной водой до указанного предела и учесть предварительное разбавление.

8.2.2 После вывода прибора в режим измерения ЕС для измерения

параметров исследуются 4 пробы, получаемые путем разбавления исследуемой пробы или раствора химического соединения дистиллированной водой в следующих отношениях 1:1, 1:2, 1:4 и 1:8. Для всех 4-х проб автоматически определяется G-функция, значения которой заносятся в оперативную память микроконтроллера прибора. По данным этих 4-х измерений микроконтроллер при нажатии специальной кнопки клавиатуры управления производит автоматически вычисление коэффициентов ЕС20 и ЕС50 и представляет данные на дисплее.

8.2.3 Определение гамма-функции для каждого из предварительно

разведенных образцов проводят в соответствии с процедурой определения показателя индекса токсичности (п. 8.1) за исключением введения дополнительной команды. При этом микроконтроллер прибора «Биотокс-10» по данным, хранящимся в оперативной памяти об интенсивности биолюминесценции в контрольных и опытных пробах (соответственно Iконтр. и Iопыт), производит вычисление гамма-функции с представлением результата на дисплее. При интенсивности биолюминесценции опыта больше или равной контролю вычисление не производится.

ОБРАБОТКА, ОЦЕНКА И ОФОРМЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

9.1 Оценку токсичности пробы проводят по относительному различию в интенсивности биолюминесценции контрольной и опытной проб и вычислению индекса токсичности «Т» и параметров ЕС20 и ЕС50. Абсолютная величина интенсивности биолюминесценции контроля не имеет принципиального значения в диапазоне допустимых значений прибора «Биотоке».

9.2 Индекс токсичности «Т» есть величина безразмерная, и определяется по формуле Т = 100 (Iконтр. - Iопыт)/Iконтр., где Iконтр. и Iопыт. соответственно интенсивность свечения контроля и опыта при фиксированном времени экспозиции исследуемого раствора с тест-объектом. Обработку результатов измерений токсичности выполняют путем расчета среднеарифметического значения величины индекса токсичности «Т» по формуле Т = (Т1 + Т2 + Т3)/3, где Т1 - Т3 - три измерений опытной пробы. Величины Т1 - Т3 получают из трех измерений контроль-опыт в короткий промежуток времени. Количество измерений Т может быть увеличено до 10.

За результат анализа ( ) принимают среднее арифметическое результатов трех (или более - до 10) параллельных.

Среднее арифметическое ( ) результатов определений количественного выражения тест-реакций вычисляется по формуле:

Среднее квадратичное отклонение результатов определений количественного выражения тест-реакции - индекса токсичности вычисляется по формуле:

где X_i- i-й результат определений, n - число параллельных определений.

Все указанные статистические параметры вычисляются измерительным прибором «Биотокс-10» автоматически по команде оператора.

Критерием приемлемости результатов, является выполнение следующего условия:

где r - предел повторяемости

Значение r приведено в разделе 2.4 методики.

При превышении предела повторяемости могут быть использованы методы оценки приемлемости результатов анализа согласно разделу 5 ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002.

9.3 Оперативный контроль воспроизводимости проводят на рабочих пробах с соблюдением условий, описанных в разделах 6, 7, 8 методики, в двух разных лабораториях.

Воспроизводимость контрольных определений, а также воспроизводимость результатов определений рабочих проб, получаемых за период, в течение которого условия проведения биотестирования принимают стабильными и соответствующими условиям проведения контрольных измерений, признают удовлетворительной, если выполняется условие:

При выполнении данного условия приемлемы оба результата анализа, и в качестве окончательного может быть использовано их среднее арифметическое значение.

При превышении предела воспроизводимости могут быть использованы методы оценки приемлемости результатов анализа согласно разделу 5 ГОСТ Р И СО 5725-6-2002.

9.4 В ряде случаев возможен вариант, когда интенсивность биолюминесценции в анализируемой пробе больше, чем в контроле. В таком случае независимо от величины отрицательного значения «Т» делается вывод об отсутствии токсичности образца, и индекс токсичности принимает нулевое значение. В случае стимуляции свечения пробой по сравнению с контролем рекомендуется для данных проб провести тестирование с использованием других биотестов.

9.5 По величине индекса токсичности (Т) анализируемые пробы классифицируются на три группы:

9.6 Прибор серии «Биотоке-10» обеспечивает в автоматическом режиме вычисление усредненного значения индекса токсичности Т, погрешности измерения индекса токсичности и токсикологических характеристик - ЕС20 и ЕС50.

9.7 Если при измерении параметров ЕС проводили дополнительное разбавление проб, то величины ЕС20 и ЕС50, представленные на дисплееприбора, следует скорректировать в сторону уменьшения объема (или в модельных экспериментах - концентрации) пропорционально кратности разбавления.

9.8 Условия и результаты биотестирования представляется в виде протокола (Приложение 1).