В результате исследования микроорганизмы помещают в про­бирки с питательной средой, содержащие разные концентрации антибиотиков. Этот метод позволяет установить минимальную концентрацию антибиотика, ингибирующую рост микроорганиз­мов. Из порошка антибиотика делают навеску и растворяют сте­рильной дистиллированной водой из расчета 1 мл — 2000 мкг/ЕД. Например, антибиотики группы тетрациклина растворяют в 0,01 N растворе соляной кислоты. Из последующего основного раствора готовят все последующие разведения антибиотиков. По­лученные растворы антибиотиков разливают в отдельные про­бирки по 1 мл.

Для разведения антибиотиков существуют стандартные пи­тательные среды (мясопептонный бульон, бульон на переваре Хоттингера), обеспечивающие оптимальные условия роста исследуемого вида и не содержащие веществ, подавляющих дей­ствие антибиотиков. В приготовленные разведения антибиоти­ка вносят бульонные культуры микроорганизмов в стационар­ной фазе роста, который соответствует 16-18 часам. После шта­тив с пробирками помещают в термостат при 37 °С на 16- 20 часов. Затем учитывают полученные результаты и отмечают последнюю пробирку с видимой задержкой микробного роста.

Количество антибиотика в этой пробирке представляет собой минимальную ингибирующую концентрацию для испытывае­мого штамма, определяющую степень чувствительности его к дан­ному антибиотику.

Методдисков. Взвесь культуры засевают «газоном». В качестве посевного материала можно использовать суточную бульонную культуру. Засеянные чашки подсушивают 30-40 минут при ком­натной температуре. Затем на поверхность засеянного агара пин­цетом накладывают бумажные диски, пропитанные растворами различных антибиотиков. Каждый диск слегка прижимают бран- шами пинцета, чтобы он плотно прилегал к поверхности агара. Диски накладывают на равном расстоянии друг от друга и на расстоянии 2 см от края чашки. Одну чашку можно использо­вать для изучения чувствительности одного штамма к 4—5 анти­биотикам.

Затем помещают их в термостат при 37 °С на 18-24 часа. Чаш­ки ставят вверх дном, чтобы избежать попадания конденсаци­онной воды на поверхность посевов.

Учет результатов. Действие антибиотиков оценивают по фе­номену задержки роста вокруг диска. Диаметр зон задержки ро­ста микробов вокруг дисков определяют с помощью линейки, включая диаметр самого диска. Между степенью чувствительно­сти микроба к антибиотикам и величиной зоны отсутствия рос­та имеются следующие соотношения:

В ответе указывают, какой чувствительностью обладает ис­следуемый штамм, а не размер зоны задержки роста. В ряде слу­чаев определяют чувствительность м/о к антибиотикам в натив­ном материале (гной, раневое отделяемое). При этом материал наносят на поверхность питательного агара и равномерно расти­рают по поверхности стерильным шпателем, а потом наклады­вают диски. Метод дисков для определения чувствительности к микроорганизмам вследствие простоты и доступности широко применяют в практических лабораториях и расценивают как ка­чественный метод.

Методы серийных разведений:

-  приготовление растворов антибиотиков;

-  приготовление питательных сред с антибиотиками;

-  приготовление суспензии исследуемого микроорганизма, ее стандартизация и инокуляция;

-  инкубация;

-  учет и интерпретация результатов.

Общим и крайне важным этапом для всех методов серийных разведений является приготовление растворов антибиотиков.

VII. Основные методы диагностики инфекционных заболеваний

Микробиологическая диагностика позво­ляет поставить или подтвердить клинический диагноз инфекционного заболевания, опреде­лить источник инфекции и чувствительность возбудителя к антибактериальным препаратам.

В микробиологической лаборатории используют различные методы диагностики:

-  микроскопический;

-  культуральный;

-  биологический;

-  серологический;

-  аллергологический;

-  молекулярно-генетический.

Микроскопический метод — обнаружение

микроорганизмов в препаратах из исследу­емого материала и их первичная морфологиче­ская идентификация. Микропрепараты могут быть нативными (изучаются микроорганизмы в живом состоянии), при этом можно опре­делить подвижность исследуемых объектов. Изучение таких препаратов осуществляется в затемненном поле зрения светового микро­скопа, а также с помощью темнопольной и фазово-контрастной микроскопии.

Исследование фиксированных и окрашен­ных различными методами препаратов дает возможность определить расположение микроорганизмов в препара­те, их размеры, компоненты клетки, отношение к окраске. Микро­скопическая техника может быть различной: световой, люминесцент­ный, электронный микроскопы и др.

Световая микроскопия из-за ничтожно малых размеров вирусов при исследовании вируссодержащего материала практически не применяется. С помощью светового микроскопа можно выявить вну­триклеточные включения, которые образуются в пораженных клет­ках при некоторых вирусных инфекциях. В этом случае чаще всего используют электронный микроскоп, реже — люминесцентный. Све­товой микроскоп можно применять лишь для обнаружения крупных вирусов, используя методы сверхокраски.

Микроскопический метод чаще используют как ориентировоч­ный, так как микроорганизм не всегда можно идентифицировать по морфологическим признакам.

Культуральный метод — посев исследуемого материала на пита­тельные среды, куриные эмбрионы, культуры клеток для выделения чистой культуры возбудителя и его идентификации. Этот метод является «золотым стандартом» микробиологического исследования, потому что позволяет успешно выделить и идентифицировать воз­будителя, хотя и является дорогостоящим, трудоемким и длительным (проводится в течение 3—5 дней, а иногда и более).

Данный метод проводят в следующих вариантах.

1. Бактериологический метод — выращивание бактериальной культуры, которую идентифицируют по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим и антиген­ным свойствам. При необходимости этот метод позволя­ет провести эпидемиологическое маркирование и определить чувствительность к антибиотикам. Иногда перед посевом про­водят первичную микроскопию исследуемого материала (это необязательный этап). Мона, кровь, фекалии, мазки из зева и носа первичнои микроскопии не подлежат. Гной, спинномоз­говая жидкость, мокрота (в разведении 10⁴—10^) подлежат микроскопии перед посевом, так как микроскопия помогает выбрать среды для посева. Выделение чистой культуры прово­дят в несколько этапов:

1-й этап — посев исследуемого материала методом, позволя­ющим получить рост отдельных колоний;

2-й этап — проверка роста колоний на питательной среде и изучение их культуральных свойств (величины, цвета, формы колоний, их прозрачности, характера поверхности, однородности структуры). Изучение культуральных свойств заканчивается приготовлением мазка из колонии и окра­ской его по Граму, определяя при этом морфологические и тинкториальные свойства бактерии. После этого проводят пересев на скошенный агар или чашку Петри для накопле­ния чистой культуры;

3-й этап — проверка чистоты накопленной культуры (гото­вят мазок, окрашивают его по Граму и микроскопируют). Если накопленная культура чистая, ее идентифицируют по биохимическим свойствам и антигенной структуре. Для биохимической дифференциации используют дифференци- ально-диагностические среды, содержащие различные суб­страты. Сахаролитические свойства изучают на средах Гиса, которые изменяют свою окраску в случае ферментации сахара бактерией и выделения при этом кислоты, которая изменяет окраску индикатора. О способности расщепления белков судят по разжижению желатины; продуктами распада белков также являются индол, сероводород и аммиак, выде­ления которых фиксируют с помощью изменения окраски индикаторных бумажек, например, пропитанной индолом, щавелевоуксусной кислотой, сероводород — уксуснокислым свинцом, аммиак — лакмусовой бумажкой;

4-й этап — оценка результатов биохимических исследований и определение таксономического положения микроорганиз­ма, что является основой антигенной идентификации.

2. Микологический метод используют при культивировании гри­бов; посев исследуемого материала проводят на специальную среду Сабуро.

3. Протозоологический метод (паразитологический) применяют при выделении простейших.

4. Вирусологический метод используют при работе с вируссодержа­щим материалом. Метод заключается в выделении вирусов при заражении исследуемым материалом лабораторных животных, куриных эмбрионов, культур клеток с последующими индика­цией вируса в зараженном объекте и его идентификацией.

5. Биологический метод (экспериментальный, биопроба) — выделе­ние чистой культуры при заражении экспериментальных животных с последующими высевом крови, секционного материала на питатель­ные среды, выделением чистой культуры и ее идентификацией. Этот метод позволяет определить факторы патогенности микроорганизма, летальную дозу, тип токсина, вырабатываемого микроорганизмом.

6. Серологический метод основан на выявлении АТ в сыворотке крови (а также в слюне и других биологических жидкостях боль­ного) с помощью известных бактериальных АГ. Этот метод позво­ляет определить количество (титр) АТ и течение инфекционного процесса по нарастанию титра АТ, а также стадию заболевания. Для этого определяют класс Ig. Обнаружение специфических Ig класса М свидетельствует об острой инфекции. При диагностике некоторых инфекций (гепатита В) определяют АГ микроорганизмов в материале от больного.

Особенностью серологического метода в вирусологии является исследование парных сывороток. Первую сыворотку берут у боль­ного в острый период, в начале болезни, и хранят при температуре 4—8 С, а вторую сыворотку — через 10—14 дней. Сыворотки иссле­дуют одномоментно. О болезни свидетельствует сероконверсия, т.е. нарастание титра АТ во второй сыворотке по отношению к первой. Диагностической является сероконверсия в 4 раза и выше. В связи с тем что многие вирусные болезни протекают остро, этот вариант серологического метода обычно применяют для ретроспективной диагностики.

7. Аллергологический метод основан на выявлении повышенной чув­ствительности к бактериальному аллергену. С этой целью проводят кожно-аллергические пробы с диагностическими аллергенами.

8. Молекулярно-генетический метод основан на идентификации воз­будителя в исследуемом материале путем определения нуклеотидных последовательностей с помощью ПЦР, молекулярной гибридизации, микрочипа и других методов молекулярной биологии.

Полимеразная цепная реакция позволяет обнаружить микро­организм в исследуемом материале (воде, продуктах, мате­риале от больного) по наличию в нем ДНК микроорганизма без выделения последнего в чистую культуру. Для проведения ПЦР из исследуемого материала выделяют ДНК, а наличие возбудителя определяют по обнаружению в выделенной ДНК специфичного для искомого микроорганизма гена. Обнару­жение гена осуществляют его накоплением. Для этого требу­ются праймеры (затравки), комплиментарные ДНК искомого гена. Накопление (амплификацию) гена выполняют следующим образом. Выделенную из исследуемого материала ДНК нагре­вают. При этом ДНК распадается на две нити. Добавляют прай­меры, смесь ДНК и праймеров охлаждают. При этом праймеры при наличии в смеси днк искомого гена связываются с его комплиментарными участками. Затем к смеси ДНК и прайме­ра добавляют ДНК-полимеразу и нуклеотиды. Устанавлива­ют температуру, оптимальную для функционирования ДНК- полимеразы. В этих условиях в случае комплементарности ДНК гена и праймера происходит присоединение нуклеотидов к З’-концам праймеров, в результате чего синтезируются две копии гена. После этого цикл повторяется снова, при этом количество ДНК гена будет увеличиваться каждый раз вдвое (рис. 9.1). Реакцию проводят в специальных приборах — ампли- фикаторах. Результат оценивается последующими денсито­метрией амплифицированной ДНК или ее электрофорезом в полиакриламидном геле. ПЦР применяют для диагностики вирусных и бактериальных инфекций.

Молекулярная гибридизация позволяет выявить степень сход­ства различных ДНК. Применяют при идентификации микро­организмов для определения их точного таксономического положения, а также для их обнаружения в исследуемом мате­риале без выделения в чистую культуру. Метод основан на спо­собности двухцепочечной ДНК при повышенной температуре (90 °С) в щелочной среде денатурировать, т.е. расплетаться на две нити, а при понижении температуры на 10 °С вновь вос­станавливать исходную двухцепочечную структуру. Метод тре­бует наличия молекулярного зонда — одноцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты, меченной радиоактивными нуклидами, ферментом, флюорохромным красителем, с которой срав­нивают исследуемую ДНК. Для проведения молекулярной гибридизации исследуемую ДНК расплетают указанным выше способом, одну нить закрепляют на специальном фильтре, который затем помещают в раствор, содержащий зонд. Соз­дают условия, благоприятные для образования двойных спи­ралей. При комплиментарности между зондом и исследуемой ДНК они образуют между собой двойную спираль, наличие которой определяют следующими методами в зависимости от типа метки зонда: подсчетом радиоактивности, иммуноферментным анализом или денситометрией.

Определение микроорганизма в исследуемом материале с помо­щью микрочипа. Микрочип представляет собой стеклянную пластинку, к которой прикреплены молекулярные ДНК- зонды, специфичные к определенным микроорганизмам. Из исследуемого образца выделяют общую ДНК, связывают ее с флюорохромом или ферментом и обрабатывают ею микро­чип, создавая условия для гибридизации. Затем отмывают не связавшуюся ДНК и определяют локализацию молекулярных гибридов постановкой ИФА или денситометрией.