Для фрагментирования используют рестриктазы (рестрикционные эндонуклеазы).

Рестриктазы узнают специфические фрагменты нуклеотидов в ДНК и «разрезают» ее в местах локализации этих последовательностей.

Образующиеся в результате рестрикции фрагменты ДНК могут быть исследованы методом электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле. Выявление ДНК в геле производится при взаимодействии с бромидом эдития, при этом комплексное соединение окрашивается в розовый цвет.

Идентификация специфических последовательностей:

Идентификация в геле нужных фрагментов осуществляется путем гибридизации с меченными ДНК-зондами (искусственно синтезированные фрагменты ДНК со строго определенной первичной структурой).

Классическим методом идентификации исследуемого участка ДНК стал блот-гибридизация по Саусерну. Суть метода: фрагменты ДНК полученные в результате деления по молекулярной массе в геле, подвергают денатурации и переносят с геля на твердый носитель. Перенос (блоттинг) осуществляется капиллярных сил, электрического поля. Фиксированную на фильтре ДНК гибридизируют с ДНК-зондом, содержащием метку. Методом радиоавтографии определяют положение искомого фрагмента геномной ДНК на электрофореграмме.

Установление первичной структуры ДНК-фрагмента (секвенирование ДНК)

Для установления первичной структуры ДНК-фрагмента используют дидезоксисеквенирование.

Денатурированную однонитевую ДНК помещают вместе с ДНК-полимеразой и дезоксинуклеозидтрифосфаты (дАТФ, дЦТФ, дГТФ, дТТФ - один из них радиоактивный).

Получение рекомбинантных ДНК и их амплификация

Получение рекомбинантных ДНК включает следующие этапы:

1. выделение ДНК из двух разных источников;

2. фрагментирование их разными рестриктазами;

3. нагревание и медленное охлаждение, образование фрагментов;

4. добавление 4 ддНТФ и синтез ДНК-копий.

Клонирование ДНК осуществляется за счет встраивания исследуемого фрагмента ДНК в векторную молекулу (плазмид, фаг, вирус), которая способствует проникновению этого фрагмента внутрь бактериальных клеток. В основном, для этой цели используют плазмиды – это небольшие кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК, присутствующие в бактериальных клетках, обладающие автономной системой контроля репликации. При этом трансформированные бактерии, т.е. введенные в них плазмиды, синтезируют копии введенного фрагмента ДНК.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР, 1983 Карри Муллисон)

Амплификация in vitro

При данном методе используют ДНК-матрицы (образцы). Участок исследуемой ДНК гибридизируют с двумя исскуственно синтезированными олигодезоксирибонуклеотидными последовательностями – праймерами.

В реакционную смесь входят: термофильный фермент ДНК-полимераза бактерий (Taq-полимераза), исследуемая ДНК, субстраты реакций (4 дНТФ), два праймера, буфер с ионами магния.

Один цикл полимеризации включает 3 этапа:

1. плавление (нагревают смесь до t 90-97ºС при этом происходит денатурация ДНК);

2. гибридизация ( отжиг ДНК с праймерами), при этом происходит снижение t до 50-60ºС и происходит комплементарное связывание двухцепочечного участка на каждой из нитей ДНК;

3. Элонгация – удлинение нитей ДНК, катализируемое Taq-полимеразой в 5’-3’ направлении.

Данный процесс осуществляется в специальных аппаратах – амплификаторах. С помощью ПЦР можно получить достаточное количество копий участков ДНК, которые предполагают присутствие мутаций, полиморфизм сайтов, поводить диагностику инфицированности различными реагентами.

ДНК-диагностика заболеваний

С помощью рекомбинантных ДНК можно исследовать точечные мутации, вызванные заменой одного азотистого основания, делецией или вставкой, приводящими к появлению аллелей, кодирующих функционально неактивные белки. Разработаттые технологии позволяют вести целенаправленное картирование генов человека в рамках международного проекта «Геном человека». Для идентификации моногенных болезней используют следующие методы:

1. Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ);

2. Аллельспецифические пробы.

ПДРФ – анализ это метод, при котором определяется нечувствительность участков с мутацией к действию рестриктаз, с помощью измерения длины рестрикционных фрагментов.

ПДРФ – анализ включает следующие этапы:

1. выделение геномной ДНК;

2. рестрикция специфической эндонуклеазой;

3. электрофоретическое разделение образующихся фрагментов ДНК;

4. Идентификация фрагментов по методу блот-гибридизации по Саузерну.

При этом на электрофорезе выявляется один крупный фрагмент или наоборот небольшой фрагмент.

Данный метод позволяет идентифицировать делецию в гене дистрофина (миодистрофия Дюшена), диагностировать гемофилию А, талассемии, гранулематоз, контролировать здоровье детей в семье и т.д.

Аллельспецифические пробы

С помощью аллель - олигонуклеотидов определяют те участки, которые не узнают ферменты рестрикции. Для этого синтезируют короткие олигонуклеотидные зонды, комплементарные участку нормального и мутантного аллеля в ДНК. Область генома, содержащую исследуемый ген, амплифицируют с помощью ПЦР, и образцы полученной ДНК переносят на нитроцеллюлозные фильтры (дот- или слот-блоттинг). Пробы выдерживают с ³²Р-зондами для выявления нормальной или мутантной последовательности.

Олигонуклеотиды, аллель-специфические по определенным мутация, можно использовать в качестве праймеров в ПЦР при клиническом тестировании населения на наличие патологического гена.