Наглядные пособия:

Рисунки: 1. Реакции последовательного восстановления убихинона вдыхательной цепи; 2. Антиоксиданты водной фазы; 3. Механизм антиоксидантного действия витамина Е; 4. Окислительно-восстановителные превращения α-токоферола и сопряженных с ним коантиоксидантов; 5. Витамин С, 6. Витамин А; 7. Повреждающее действие свободных радикалов на компоненты клетки; 8. Образование супероксида в ЦПЭ,

V Наименование лабораторной работы:

VI Перечень вопросов для проверки исходного уровня знаний:

ЛАБОРАТОНАЯ РАБОТА №1

Количественное определение малонового диальдегида в ткани печени.

ОБОРУДОВАНИЕ: баня, ФЭК.

ПРИНЦИП МЕТОДА.

Основан на определении малонового диальдегида (МДА) как показателя перекисного окисления липидов при инкубации гомогенатов тканей в присутствии кислорода. В присутствии прооксидантов МДА определяется по специфической цветной реакции в кислой среде с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК).

ХОД РАБОТЫ.

 В трех центрифужных пробирках приготовить инкубационную смесь реактивов по следующей схеме:

Все пробирки поместить в термостат при 37оС на 15 минут. После инкубации остановить реакцию в 1 и 3 пробирках, добавляя в них по 1 мл ТХУ с ЭДТА, перемешать. Все пробирки центрифугировать в течение 20 минут при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость осторожно слить в чистые пробирки. Затем в другие чистые пробирки отобрать по 4 мл надосадочной жидкости, добавить по 2 мл свежеприготовленного раствора ТБК (тиобарбитуровая кислота) и поместить пробирки в кипящую баню на 15 минут. Пробирки охладить в холодной воде и определить оптическую плотность на ФЭКе с зеленым светофильтром (длина волны 540 нм) в кювете 10 мм.

РЕЗУЛЬТАТЫ:

Активность ПОЛ выражается количеством микромолей МДА, накопленного за период инкубации в 1 мл гомогената

.

, где

Х - количество МДА, накопленного за период инкубации в 1 мл гомогената,

- молярный коэффициент экстинкции для малонового диальдегида при реакции с ТБК, численно равный 0.156.

Dоп и D конт - оптические плотности "опытной" и "контрольной" пробирок соответственно.

Рассчитать активность ПОЛ в 1 и 3 пробирках и сделать вывод об активности ПОЛ и влиянии ионов Fe2+ и аскорбата на перекисное окисление липидов.

РАСЧЕТ И ВЫВОДЫ:

ЛАБОРАТОНАЯ РАБОТА №2

Количественное определение каталазы в крови.

ПРИНЦИП МЕТОДА.

В основе количественного определения активности каталазы лежит определение количества перекиси водорода, разложенной ферментом за определенный промежуток времени. О количестве расщепленной перекиси водорода судят по разности количества перманганата калия. израсходованного на титрование перекиси водорода до и после действия каталазы.

Активность каталазы выражают с помощью каталазного числа. Каталазным числом называют количество мг перекиси водорода, которое разлагается под действием 1 мкл крови.

ХОД РАБОТЫ.

Работу проводят по следующей схеме:

Действие каталазы в кислой среде прекращается, т. к. этот фермент действует при рН=7,4. Поскольку в контрольную пробу серную кислоту приливали до добавления перекиси водорода, то в контроле все добавленное количество перекиси водорода остается нерасщепленным.

Содержимое каждого стаканчика необходимо титровать раствором перманганата калия до розового окрашивания, не исчезающего в течение 30 сек.

Рассчитать каталазное число (КЧ) по формуле:

КЧ = (А - В) х 1,7,

где:

А - кол-во 0,1 N раствора КМnО4, пошедшее на титрование контрольной пробы в мл.

В - кол-во 0,1N раствора КМnО4, пошедшее на титрование опытной пробы в мл.

1,7 - это коэффициент, показывающий, сколько мг Н2О2 содержится в 1мл 0,1н. раствора Н₂О₂.

 В норме каталазное число колеблется от 10 до 15 единиц у взрослых и 7,5 - 9,9 единиц у детей.

РАСЧЕТ И ВЫВОДЫ: 

Самостоятельная работа: составление тестов и кроссворда по теме ПОЛ.

Тестовый контроль:

Тема: ПОЛ.