Как уже отмечалось ранее, традиционным способом получения клонов у древесных видов растений является черенкование с пос­ледующим укоренением черенков или прививкой. Клональное мик­роразмножение является принципиально новым способом получе­ния клонов, основанным на методе культуры органов и клеток in vitro . С помощью этого способа за довольно короткий срок можно получить большое количество однородного посадочного материа­ла. Клональным микроразмножением называют массовое бесполое размножение растений в культуре тканей и клеток, при котором возникшие формы растений генетически идентичны исходному экземпляру (Н.В. Катаева, Р.Г. Бутенко, 1983). Клональное микро­размножение значительно ускоряет селекционный процесс; при размножении растений в культуре тканей происходит оздоровле­ние посадочного материала, освобождение его от патогенных мик­роорганизмов и во многих случаях от вирусов. Методом культуры тканей удается размножить растения, которые с трудом или совсем не размножаются вегетативно.

Общая характеристика

Метода клонального микроразмножения

В зависимости от вида исходного материала (эксплантата, или экспланта) и характера морфогенетических процессов различают­ся типы, или методы клонального микроразмножения. Для древес­ных растений наиболее распространенной является классификация, согласно которой микроклонирование можно проводить тремя пу­тями:

· стимуляцией распускания пазушных почек;

• индукцией образования придаточных почек и адвентивных побегов из них;

•  соматическим эмбриогенезом. Для лиственных пород приме­нимы все три пути; для хвойных — только второй и третий.

Метод клонального микроразмножения путем стимуляции рас­пускания существующих на побеге пазушных почек основан на сня­тии апикального доминирования, что достигается или удалением апекса побега, или гормональной обработкой, или сочетанием того и другого. При этом во всех случаях развившиеся побеги отделяют и повторно культивируют на питательной среде, стимулирующей пролиферацию (прорастание) пазушных меристем.

Образование адвентивных (придаточных) побегов как метод мик­роразмножения основан на способности изолированных частей ра­стения при определенных условиях регенерировать целое растение. Почти любые органы и ткани растений можно использовать в каче­стве эксплантата, если их удается надежно стерилизовать.

Соматические эмбрионы могут возникать или в культуре каллу­са, или непосредственно в культуре тканей экспланта. Для индук­ции соматического эмбриогенеза у разных видов растений необхо­димы специфичные для данного вида регуляторы роста.

Накопленный к настоящему времени значительный опыт по клональному микроразмножению древесных растений свидетельствует о том, что эффективность этого метода зависит от морфогенетической и регенерационной активности изолированных органов, тка­ней и клеток растения, что в значительной степени связано с видо­выми и генотипическими особенностями дерева, его возрастом и физиологическим состоянием, условиями культивирования эксплантов и особенности питательной среды. Поэтому универсальной технологии клонального микроразмножения, пригодной для всех растений или даже одной группы растений, нет. Питательные среды и условия культивирования, так же как тип клонального микрораз­множения, для каждого вида, а часто и для конкретного генотипа подбираются опытным путем.

Организация работ по клональному

Микроразмножению растений

Многие операции по микроразмножению растений должны про­водиться в стерильных условиях. С учетом этого основного требо­вания приобретается оборудование и подбираются помещения. Ла­боратория, в которой будут проводиться работы по клональному микроразмножению, помимо комнат для сотрудников, должна иметь ряд специализированных комнат, в первую очередь комнату для стерилизации питательных сред, инструмента, посуды. Эту комнату оборудуют автоклавами, сушильными шкафами, дистиллято­ром, установленным над раковиной. Следующая комната, в кото­рой готовятся питательные среды, должна быть оборудована техни­ческими и аналитическими весами, рН-метром, водяными банями, вытяжным шкафом. В этой комнате находятся физические и хими­ческие столы, шкафы и полки для размещения реактивов, прибо­ров, посуды.

В связи с большим количеством стеклянной посуды, используе­мой в работе, необходимо предусмотреть моечную комнату с глубо­кой и широкой мойкой и несколькими раковинами с холодной и горячей водой. В лаборатории должна быть комната, оборудован­ная ламинарными боксами. Ламинарбокс представляет собой не­большую камеру, в которую воздух подается под давлением через специальные фильтры. Избыточное давление, создаваемое внутри рабочего объема камеры, препятствует попаданию в камеру неочи­щенного воздуха. В большой лаборатории должна быть климати­ческая камера. В этой камере автоматически регулируется освещен­ность, температура, влажность и фотопериод. Камеру оборудуют стеллажами, на которые устанавливают штативы с пробирками, культуральные колбы. Для выращивания в почве размноженных в культуре органов и тканей регенерантов следует иметь специаль­ную теплицу.

Питательные среды

Эффективность микроразмножения в значительной степени оп­ределяется правильным выбором питательной среды. Для культи­вирования органов и тканей растений чаще применяют твердую агарсодержащую среду, так как в жидкой среде эксплантаты тонут. Любая питательная среда включает следующие группы веществ: макро- и микроэлементы, углеводы, витамины, аминокислоты, ре­гуляторы роста гормональной природы.

При клональном микроразмножении растений наиболее часто используют среду Мурасиге — Скуга (Murashige, Skoog, 1962). От­личительной особенностью этой среды является высокая концент­рация неорганического азота. Уровень солей в среде Мурасиге — Скуга в некоторых случаях оказался неоправданно высоким и ток­сичным для эксплантов. Поэтому для древесных растений некото­рые исследователи отдают предпочтение среде WPM (Woody Plant Medium). Эта среда отличается от среды Мурасиге — Скуга (MS) тем, что содержит меньше азотнокислого аммония, а вместо азот­нокислого калия добавляется азотнокислый кальций (табл. 10.1).

Таблица 10.1