Основные понятия и термины по теме: среды для хранения спермы, компоненты разбавителей, хранение спермы при разных температурах.

План изучения темы:

1. Разбавление спермы.

2. Хранение спермы.

3. Транспортировка спермы.

Краткое изложение теоретических вопросов:

Значение и необходимость разбавления спермы                                                             

Во время эякуляции к содержимому эпидидимиса примешиваются секреты придаточных половых желез. Они изменяют рН среды, насыщают плазму электролитами (соли натрия, калия, магния); последние вызывают разрушение липопротеидного покрова спермиев. Отмеченные сдвиги обуславливают переход спермиев из анабиоза в активное состояние; это, в свою очередь, приводит к быстрой их гибели.                                                                                                         Непосредственными причинами сокращения срока жизни спермиев вне организма являются:                                                                                                              

- истощение источников энергии в спермальной плазме и самих спермиях;                                                                                                                             - интоксикация продуктами жизнедеятельности спермиев;                            - разрушение липопротеидного покрова, набухание мембран и снятие электрического заряда;                                                                                        - отрицательное действие находящихся в сперме и размножающихся в ней микроорганизмов;                                                                                          

- температурные перепады.                                                               

Следовательно, для продления срока жизни спермиев во внешней среде требуется:    

 - уменьшить активность спермиев;                                                                       

 - обеспечить их дополнительными источниками энергии;                                               

- защитить мембраны спермиев от разрушения;                                                

 - предотвратить накопление токсических продуктов метаболизма;                          - блокировать размножение находящихся в сперме микроорганизмов;        

- повысить устойчивость спермиев к температурным перепадам и криогенным воздействиям.                                                                              

Это достигается применением специальных разбавителей. Помимо защитных функций, разбавление спермы облегчает дробление эякулята на порции (сперм дозы). Это особенно существенно для животных с маточным типом естественного осеменения (свиньи, лошади), поскольку сперм доза наряду с нормативным числом подвижных спермиев должна быть достаточно объемной.                                                                                      

Синтетические и биологические среды для хранения спермы                     Разбавители могут быть биологическими и синтетическими (искусственными) средами. Из биологических сред использовалось коровье молоко, кокосовое молоко, 7%-ный раствор пчелиного меда, а также томатный сок. Применяемые в настоящее время разбавители спермы сельскохозяйственных животных относят к синтетическим средам. Синтетическая среда обычно состоит из трех и более компонентов, например, глюкозо-цитратно-желточная среда (ГЦЖ).                                   

 Основные компоненты разбавителей и их роль                                                               В состав большинства разбавителей входят следующие компоненты:                     Сахара (глюкоза, лактоза). Служат источником энергии для спермиев. Помимо этого они участвуют в поддержании осмотического давления, понижают электропроводность среды, предохраняют спермии от потерь электрического заряда.                                                                                              Цитрат натрия. Создает буферность среды, нейтрализует конечные продукты жизнедеятельности спермиев, связывая ионы кальция и тяжелых металлов.                                                                                                 Трис-буфер (2-амино-2-гидроксиметил-1, пропандиол). Устойчиво удерживает первоначальную рН среды, обладает осмотическим действием, устраняет явления дыхательного ацидоза в спермиях.                                                                                         

 Трилон Б (хелатон, двунатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты). Образуя временные связи с ионами кальция, тормозит активность протеаз, АТФаз и других ферментов, участвующих в метаболических процессах в спермиях.                                                                                                                     ЭДТА (тринатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты). Подобно трилону Б, образует хелатные комплексы с ионами кальция, тем самым блокирует активность ферментных систем спермиев.                                           

 Сульфат аммония. Предохраняет от разрушения сульфгидрильные группы в мембранах спермиев, задерживает выход электролитов в окружающую среду.                                                                         Глицерин. Обладает крио протекторными свойствами, легко проникает внутрь спермия, понижает температуру замерзания и препятствует образованию кристаллов связанной воды, что позволяет избежать повреждений клеточных структур. Благодаря высокой гидрофильности препятствует дегидратации цитоплазмы.

        Желток куриных яиц. Содержит лецитин липопротеины, которые создают на поверхности спермия адсорбционный слой, предохраняющий его от холодового шока.                                                                                                Спермосан ППК. Комплексный антибактериальный препарат, состоящий из пенициллина, полимиксина, канамицина. Такая комбинация эффективно тормозит размножение микроорганизмов в сперме. В состав некоторых разбавителей входят антиоксиданты (токоферол), загустители (гуммиарабик), свободные аминокислоты (гликокол, аргинин) и другие компоненты.                               

Санитарно-гигиенические требования к приготовлению сред и разбавлению спермы                                                                                                                          Для приготовления сред и разбавления спермы отводят специально оборудованное лабораторное помещение со средствами стерилизации воздуха и предметов (бактерицидные лампы). Колбы, мерные цилиндры, пипетки, бумажные фильтры и другие принадлежности накануне взятия спермы стерилизуют в сушильном шкафу при температуре 130-150 С; перед использованием их переносят в термостат с постоянной температурой 37С. Для приготовления сред используют дистиллированную воду, имеющую рН 6,8-7,0. Пригодны только химически чистые и проверенные на безвредность для спермиев сухие компоненты. Их хранят в герметически закрытых стеклянных банках в темном месте. Яйца используют только свежие (со сроком хранения до 7 суток), полученные от здоровых кур при выгульном их содержании.                                                                                                                    Хранение спермы при температуре +2…+5°С                                                    

Сперму, сохраняемую при +2…+5°С, разбавляют глюкозо-цитратно желточной, молочно-желточной, глюкозо-цитратножелточной с хелатоном и аргинином, гликокол-цитратно-желточной средами. После разбавления сперму расфасовывают в одноразовые стерильные полиэтиленовые ампулы, полиэтиленовые пробирки или во флаконы из-под антибиотиков; их обертывают теплоизолирующим материалом (для постепенного охлаждения), заключают в полиэтиленовый пакет. Пакеты с расфасованной спермой вкладывают в широкогорлый термос со льдом или помещают на полку бытового холодильника. Сперму быков и хряков используют в течение трех суток, барана – в течение суток.                                                                                                 Хранение спермы при температуре +16…+20°С Вандемарк и Шарма из Иллинойского университета (США) в 1957 г. сообщили о разработанном ими методе краткосрочного хранения спермы быков без охлаждения. Для иммобилизации спермиев они применяли угольную кислоту, которую получали посредством насыщения углекислым газом специального разбавителя (ИВТ) до величины рН 6,3-6,35. Разбавленную сперму хранили в запаянных стеклянных ампулах, заполненных на 2/3 объема, при 18-20°С. Сперма была пригодна для осеменения в течение 3 суток. В среде, предложенной А.А. Зальцманом (ТВТ-12), угольная кислота была заменена на лимонную кислоту. Краткосрочное хранение спермы при плюсовых температурах путем блокирования метаболических процессов в спермиях основано на использовании трилона Б (хелатона). Среды с хелатоном получили широкое применение в практике искусственного осеменения свиней. Наиболее эффективной оказалась глюкозо-хелато-цитратно-сульфатная среда (ГХЦС-среда). Разбавленную ГХЦС-средой сперму хранят и используют в течение 3 суток.                                                                                       Замораживание и хранение спермы при температуре -196°С в жидком азоте                                                                                                                       Для замораживания пригодна сперма быка с активностью спермиев не ниже 8 баллов и концентрацией их не менее 0,8 млрд в 1 мл. Замораживают сперму быков в гранулах (0,1-0,2 мл). Эта расфасовка обеспечивает более эффективное использование сосудов Дьюара для хранения спермы, несколько лучшую выживаемость и оплодотворяющую способность спермиев. После оценки сперму разбавляют средой № 1 (11%-ный раствор лактозы – 63 мл, желтка – 30 мл, глицерина – 7 мл) в соотношении 1:1, затем средой № 2 (11%-ный раствор лактозы – 81,5 мл, желтка – 15 мл, глицерина – 3,5 мл), доводят степень разбавления до нужного показателя. Для замораживания спермы гранулами по 0,5-1 мл используют среду: вода дистиллированная – 100 мл, лактоза – 11,5 г, желток куриного яйца – 20 мл, глицерин – 5 мл. После разбавления сперму охлаждают при +2…+5оС в течение 4-7 ч. Затем берут фторопластовую пластину, на которой с двух сторон имеется по 300-324 лунки для накапливания спермы, обеззараживают ее с помощью бактерицидных ламп, опускают в широкогорлый сосуд с жидким азотом и охлаждают до тех пор, пока прекратится кипение азота. Охлажденную пластинку приподнимают над поверхностью жидкого азота и при помощи шприца наносят разбавленную сперму объемом по 0,1 мл в каждую лунку. Спустя 2-3 минут после нанесения спермы в последнюю лунку, пластинку погружают в жидкий азот на 1-2 мин. После этого, вынув пластинку, замороженные гранулы собирают в пластмассовые коробочки с небольшими отверстиями (или в марлевые мешочки) и хранят их в жидком азоте. Главным недостатком замораживания спермы в гранулах является их незащищенность. Длительность хранения замороженной спермы в жидком азоте на плем. предприятиях осуществляют в специальных помещениях (хранилищах), в которых установлены стационарные емкости ХБ-0,5 или КВ-6202. Транспортируют сперму и хранят на пунктах искусственного осеменения в сосудах Дьюара различной емкости (от 4 до50 л жидкого азота).Азот доставляется на пункты искусственного осеменения в транспортных резервуарах, установленных на автомобилях высокой проходимости.                                                                                Транспортировка спермы.                                                                                     

Для перевозки спермы в хозяйствах используют термоса различной конструкции. Основной частью такого термоса является вакуумный сосуд Дьюара — двустенная колба с выкаченным воздухом из меж стенного пространства. При хранении спермы при 2—4 °С для перевозки термос заполняют мелкими кусками тающего льда до половины объема. На лед кладут полиэтиленовую пленку и вату. Пленка защищает вату от намокания, а вата обеспечивает медленное охлаждение спермы. Транспортировать сперму в хозяйства можно всеми видами транспорта (автомашинами, поездами, самолетами, лошадьми и т. д.). При этом особенно тщательно следят за упаковкой, не допускают ее повреждения, поддерживают нужную температуру. Если сперма доставляется в хозяйства не транспортом станции, а почтой или через передаточные пункты, то термос обязательно опломбировывают и прикрепляют ярлыки с адресом получателя. Вместе со спермой в хозяйства направляют ордер в двух экземплярах. В легковом автомобиле или в другом транспорте термоса со спермой фиксируют путем постановки их вплотную друг к другу и заполняют пространство между ними амортизирующими прокладками. Если перевозка производится при температуре ниже 5 термос защищают от охлаждения ватным или шерстяным чехлом. Для перевозки спермы в жидком азоте (—196°) применяют специальные металлические сосуды Дьюара различной емкости — от 5 до 30 л. Сосуды закрепляют на машине так, чтобы они не могли перевернуться. На месте получения сосудов с замороженной спермой прежде всего необходимо установить — имеется ли в сосуде в достаточном количестве жидкий азот, то есть покрыта ли сперма им сверху. Перед использованием сперма должна быть обязательно проверена на активность. Для этого техник при помощи пинцета извлекает сперму, быстро переносит в воду температурой 40°. Если это гранула, то ее помещают в емкость объемом 1 мл с 2,9%-ным раствором цитрата натрия такой же температуры. Сперма пригодна для осеменения, если в ней имеется 30% и больше активных спермиев с прямолинейно-поступательным движением (3 балла). При работе с жидким азотом необходимо соблюдать осторожность. Попадание жидкого азота на открытые участки тела может оказывать воздействие на кожу и даже ожог, поэтому работать нужно в защитных очках, перчатках. При заливке жидким азотом хранилищ и сосудов нельзя заглядывать в горловину, так как может быть выброс хладагентов. Во время эксплуатации емкости с жидким азотом нельзя плотно закрывать се, так как накопление паров может привести к взрыву. При транспортировке сосуд должен быть хорошо закреплен во избежание падения и перевертывания. Перевозимые авиатранспортом сосуды заливаются на половину емкости во избежание выплескивания при подъеме и посадке самолета. Не допускается обогащения жидкого азота кислородом, так как это может привести к накоплению взрывоопасной смеси. Проверка проводится газоанализатором 2 раза в год и при наличии 15% кислорода сосуд опорожняют. Помещение, где стоят сосуды с жидким азотом, должно быть оборудовано приточно-вытяжной или принудительной вентиляцией. Повышение концентрации азота может вызвать головокружение и потерю сознания у людей.

Раздел 3: Организация искусственного осеменения.

Тема 3.1 Техника осеменения самок и способы повышения оплодотворяемости.                                                                                                      Основные понятия и термины по теме: искусственное осеменение различными способами.                                                                                                    План изучения темы:                                                                               

1. Физиологические основы искусственного осеменения.                                                   

 2. Время осеменения самок.

3. Ветеринарно-санитарные правила при осеменении.

4. Искусственное и естественное осеменение

Краткое изложение теоретических вопросов:

1.Физиологические основы искусственного осеменения.                

 Техника искусственного осеменения самок животных разных видов основаны на особенностях строения половых органов. Кроме этого, особое значение приобретает скорость перемещения спермы, зависящая от состояния самки. Чем ближе момент овуляции, чем выше нервный и гормональный тонус половых путей, тем быстрее спермии перемещаются. Фолликулярная жидкость при овуляции поступает сначала в яйцепровод, затем в матку и приводит спермии в активное состояние. В половых органах коров, овец и крольчих спермии сохраняют жизнеспособность в среднем 36-48 час, свиней – 24-48 час, у кобыл до 90 час, у собак до 6-7 суток. Спермии птиц в отличие от спермиев животных сохраняются до 35 дней и более.                        

 2.Время осеменения самок                                                                                          

После овуляции (процесс высвобождения яйцевой клетки из фолликула яичника) яйцеклетки в яйцепроводах сохраняют способность и оплодотворяющую способность к оплодотворению всего лишь 2-6 час, у собак 2-3 дня. У коров и телок фолликулы (в отличие от других) овулируют через 10-15 час после окончания охоты, поэтому их осеменяют в середине и в конце охоты. У кобыл, овец, коз, свиней и собак фолликулы овулируют во вторую половину охоты спонтанно. Характерная особенность крольчих провоцированная овуляция: для разрыва фолликулов необходимо спаривание. У домашних птиц яйца образуются спонтанно вовремя всего периода яйцекладки (сезон)                                                                               3.Ветеринарно-санитарные правила при искусственном осеменении                                                                                                                   Для того чтобы предотвратить опасность распространения заболеваний, необходимо строго соблюдать следующие правила:                                                              

А) техники по искусственному осеменению животных в чистых халатах, колпаках и косынках, а в неблагополучных по инфекционным болезням хозяйствах в фартуках и резиновых сапогах                                                                          

Б) инструменты для искусственного осеменения, приборы, посуда и оборудование должно быть стерильным                                                                        

В) шприцы – катетеры стерилизуют в разобранном виде: кипятят 15-20 минут при закрытом стерилизаторе.                                                                              

    Г) влагалищное зеркало можно дезинфицировать с помощью 96% этанола с последующим обмыванием стерильным раствором 1% NaCl.                             

Д) перед искусственным осеменением самок (коров, телок, кобыл, овец, коз, свиноматок) фиксируют в специальных станках (или стойлах). Наружные половые органы обмывают чистой водой из кружки Эсмарха, орошают раствором фурацилина (1:5000), фуразолидона (1:1000), насухо вытирают, раскрывают половые губы самок и вводят стерильные инструменты. Влагалищное зеркало обязательно предварительно увлажняют теплым стерильным 1% раствором хлорида натрия.