Тема моей дипломной работы была связана с изучением различных окислительных реакций, в частности, реакций окислительной модификации флавоноидов (силимарина, силибинина и т.д.) ферментами микросомальной фракции клеток печени. Учитывая специфику данной темы, пакет программ Cary WinUV Bio Pack Software, а именно, раздел Scanning Kinetics, стал незаменимым в моей лабораторной практике.
В рамках изучаемой мною темы существует три основные задачи, решить которые позволяет вышеупомянутое приложение Scanning Kinetics:
1. изучить возможность окислительного превращения субстрата ферментом;
2. подобрать оптимальные концентрации действующих реагентов в целях получения максимального количества продукта.
3. идентифицировать продукт данной окислительной реакции;
Первая задача решается за счёт сканирования субстратов (силимарина, силибинина), ферментов реакции (микросомальной фракции) и раствора, содержащего предполагаемые продукты реакции, на определённом интервале длин волн с последующим сравнением полученных спектров.
Как уже упоминалось, каждое вещество в зависимости от своего химического строения поглощает свет в строго определённом участке (или нескольких участках) электромагнитного спектра, т.е. кванты определённой длины волны. На спектре поглощения это проявляется в виде пика (или нескольких пиков) и соответствует максимуму поглощения вещества. Когда фермент и субстрат вступают в реакцию, происходит постепенное превращение исходного субстрата в промежуточный продукт, а промежуточного продукта в конечный. При этом ОП раствора на тех длинах волн, которые соответствуют максимумам поглощения исходных реагентов (фермента и субстрата), уменьшается, так как происходит их постепенное расходование в реакционной смеси. Одновременно на спектре поглощения начинают появляться новые пики, которые свидетельствуют о накоплении конкретного продукта реакции (рисунок 9). Таким образом, если спектральный анализ указывает на появление новых максимумов поглощения, отличных от таковых для фермента и субстрата, то это свидетельствует о возможности окислительной модификации исходного соединения.
 |
Рисунок 9 – Зависимость спектров поглощения промежуточного и конечного продуктов микросомального окисления силимарина от времени
Вторая задача решается эмпирическим путём: подбором различных концентраций действующих реагентов (флавоноидов и микросомальной фракции), проведением реакций при различных соотношения фермента и субстрата, а также в присутствии определённых коферментов, кофакторов, например, пероксида водорода, НАДФ, НАДФН и т.д. При запуске той или иной реакции учитывается скорость возрастания пика, соответствующего гипотетическому продукту реакции. Это позволяет сделать кинетический компонент описываемого приложения, благодаря которому можно прописывать спектры поглощения продуктов в зависимости от времени. Исследователь задаёт прибору время, в течение которого необходимо проводить измерения, а также интервал времени (цикл), через который будет прописываться новый спектр. Эти значения также подбираются опытным путём и зависят от скорости протекания реакции. Так, в реакции окисления флавоноидов ферментами микросомальной фракции общее время измерения равнялось 5 мин, а интервал записи спектров - 20 сек. Таким образом, сняв зависимость скорости накопления продукта от концентраций исходных реагентов и дополнительных факторов, можно сделать вывод об оптимальном наборе и концентрациях реагирующих веществ.
Третья задача, состоящая в идентификации полученных в ходе реакции продуктов решается просто только в том случае, если в литературе имеются некоторые предварительные наработки по данному вопросу. Получив определённый продукт и записав спектр его поглощения, мы определяем одну из важнейших его характеристик, которая косвенно указывает на качественный состав данного соединения, - максимум поглощения вещества. Важно понимать, что максимум поглощения вещества в большинстве случаев не даёт нам точных сведений о его структуре, он указывает лишь на наличие определённых структур - хромофоров, которые вносят вклад в развитие пика. Точная идентификация продукта СФ методом возможна лишь тогда, когда в биохимических справочниках имеются соответствующие данные о максимумах поглощения конкретных соединений. Например, известно, что гемоглобин имеет максимум поглощения при 406 нм, продукт окисления тетраметилбензидина - при 450 нм и т.д
В связи с этим, мне хотелось бы внести предложение, реализация которого, на мой взгляд, значительно облегчила бы идентификацию продуктов СФ методом. Данное предложение заключается в создании компьютерной базы данных (БД) спектров поглощения различных веществ. Эта БД может отображать результаты работы отдельного исследователя, посвящённой конкретной теме (т.н. индивидуальная БД). Индивидуальная БД может находиться на персональном компьютере исследователя и служить для решения его собственных задач в узкой области исследований. БД спектров поглощения могла бы создаваться на основе исследований целого коллектива научных сотрудников, т.н. корпоративная БД, либо целого сообщества учёных, например, Беларуси, России, стран СНГ, Евросоюза. Такая всеобъемлющая БД была бы доступна в сети Internet, а каждый, кто заинтересован в содержащейся в ней информации, мог бы воспользоваться данными из этой системы. Дополнение БД новыми спектрами проводилось бы на основании строгих критериев при соблюдении всех условий эксперимента. Наша гипотетическая БД могла бы не только представлять собой перечень спектров самых разнообразных веществ, но и позволяла бы анализировать полученный рядовым исследователем график в on-line режиме на соответствие, точное или приблизительное, имеющимся в БД спектрам. Данная программа могла бы выдавать весь перечень схожих спектров и предполагать возможную структуру неизвестного соединения, исходя из степени схожести его спектра поглощения со всеми имеющимися в перечне. На мой взгляд, эта идея вполне осуществима и при условии её воплощения будет пользоваться большим спросом.
Заключение
На сегодняшний день ИТ внедрены фактически во все сферы человеческой деятельности, включая науку. В биохимии существует множество точек приложения компьютерным технологиям. Одной из таких областей, где ИТ прочно закрепили свои позиции, является область спектрофотометрического анализа. Наглядным примером успешного взаимодействия биологии и ИТ является ПО для спектрофотометров Cary Win UV. Модульная структура данного ПО позволяет пользователю решать самые разнообразные задачи: производить различного рода измерения, вычисления, представлять информацию в виде отчётов и графиков. Пакеты программ Cary Win UV просты в эксплуатации и незаменимы в современной лабораторной практике.
Несмотря на несомненный прогресс в применении ИТ в биологии, некоторые вопросы, как видно, ещё требуют доработки и совершенствования. На мой взгляд, биологи, даже самые неопытные в сфере ИТ не должны бояться вносить свои предложения по внедрению новых программ в биологические исследования. Более того, инициатива должна, в первую очередь, исходить от биологов, так как кому, как не нам, знать "слабые места" компьютерных технологий в нашей науке.
Список литературы к реферату
1. Бондаренко, С. Microsoft Word 2003 в теории и на практике / С.Бондаренко, М.Бондаренко. – Минск: Новое знание, 2004. – 336 с.
2. Булатов, М.И. Практическое руководство по фотометрическим методам анализа. М.И. Булатов, И.П. Калинкин / СПб.: Химия, 1986. – 432 с.
3. Новиков, Ф. Microsoft Office XP в целом: наиб. полное рук-во. Для широкого круга пользователей / Ф.Новиков, А.Яценко. – СПб.: БХВ-Петербург, 2002. – 917 с.
4. Уильямс, Б. Методы практической биохимии / Б. Уильямс, К. Уилсон / Пер. с англ. С.Е. Северина, А.Д. Виноградова. – М.: Мир, 1987. – 260 с.
5. http://www.fizlabpribor.ru/Varian/Cary50.php
6. http://www.labdepot.ru/analit/fotom.html
Предметный указатель
ADL, 4, 5
Advanced Reads, 5, 11
Cary, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 16
Cary Win UV, 4, 5, 16
Cary WinUV, 4
Concentration, 5, 7
cигнал-шум, 10
DNA / RNA, 5, 6, 11
Enzyme Kinetics, 5, 6, 8, 9
Kinetics, 6, 7, 9
Pack Software, 5, 6, 13
Scan, 6, 9, 11
Scanning Kinetics, 6, 11, 13
Simple Reads, 6
Thermal, 6, 12
база данных (БД), 15, 16
всеобъемлющая БД, 15
индивидуальная БД, 15
корпоративная БД, 15
информационные технологии (ИТ), 1, 16
ИТ, 13, 16
максимум поглощения, 2, 14, 15
микросомальная фракция, 13, 14, 15
НАДФ, 14
НАДФН, 14
оптическая плотность (ОП), 2, 3, 7, 9, 14
ПО, 4, 5, 16
светопоглощающение, 3
светопоглощение, 2, 3, 7
сигнал-шум, 10
силибинин, 13
силимарин, 13
спектр, 2, 9, 11, 13, 14, 15, 16
спектрофотометр, 4, 7, 9, 10, 12
спектрофотометрия, 1, 2
СФ метод, 1, 2, 3, 15
флавоноид, 13, 14, 15
хромофор, 2, 15
Дата: 2019-12-10, просмотров: 306.
