Методы анализа, основанные на поглощении световой энергии атомами и молекулами анализируемых веществ, представляют обширную группу абсорбционных оптических методов. В рамках данной группы особую роль играет спектрофотометрия - физико-химический метод исследования растворов и твёрдых веществ, основанный на избирательном поглощении света молекулами вещества в ультрафиолетовой (УФ) (200—400 нм), видимой (400—760 нм) и инфракрасной (ИК) (>760 нм) областях спектра.

1.1.1 Основные закономерности светопоглощения

В зависимости от химической структуры каждое соединение поглощает свет строго определённой длины волны (конкретный участок электромагнитного спектра). Спектр поглощения вещества представляет собой зависимость количества поглощенного света от длины волны. При определённой длине волны наблюдается максимальное поглощение света анализируемым веществом, что на спектре проявляется в виде характерного пика. Окрашенные растворы в видимой области (400–700 нм) иногда имеют несколько максимумов поглощения, в этом случае на спектре регистрируется несколько пиков.

Положение максимума поглощения является важной оптической характеристикой вещества, а характер и вид спектра поглощения характеризуют его качественную индивидуальность. Группа в молекуле, которая дает вклад в спектр ее поглощения называется хромофором. Такой группой является, например, карбонильная группа >С=О, существующая у всех аминокислот; пептидная группа полипептидных цепей; остатки ароматических аминокислот в составе белков; азотистые основания нуклеотидов в составе нуклеиновых кислот.

При прохождении через слой вещества (раствора) светового потока с интенсивностью I₀ его интенсивность в результате поглощения в слое уменьшается до значения I. Интенсивности падающего светового потока I₀ и светового потока I, прошедшего через раствор, можно определить экспериментально. Поглощение излучения характеризуют понятием ОП (оптической плотности):

Между концентрацией поглощающего раствора и его ОП существует прямо пропорциональная связь:

где k₁ – коэффициент пропорциональности;

С – концентрация растворенного вещества.

Таким образом, измерив экспериментально с помощью спектрофотометра ОП раствора (разность между интенсивностью падающего и прошедшего через раствор светового потока) можно вычислить концентрацию анализируемого вещества.

1.1.2 Роль СФ методов в биохимии

СФ методы анализа обладают рядом преимуществ перед другими аналитическими методами, используемыми в биохимии:

1. позволяют количественно определять содержание элементов и органических веществ в широком интервале длин волн от 185 до 1100 нм;

2. дают возможность количественного анализа многокомпонентных систем (одновременного количественного определения нескольких элементов);

3. позволяют определять состав светопоглощающих комплексных соединений, а также константы их устойчивости и константы диссоциации органических реагентов;

4. позволяют изучать химические равновесия и определять фотометрические характеристики светопоглощающих соединений.

Несмотря на интенсивное развитие других аналитических методов, по-прежнему эффективно и широко используются СФ методы. Это обусловлено следующими обстоятельствами:

1. наличием различных СФ методов практически на все элементы периодической системы и многочисленные органические вещества;

2. возможностью использовать доступную аппаратуру для проведения фотометрических определений с достаточно высокой точностью;

3. широким выбором СФ методов и методик, позволяющих проводить определение элементов в интервале содержаний от 100 до 10-6%, включая анализ веществ высокой степени чистоты и микрообъектов.

Основными направлениями в развитии современных СФ методов анализа являются повышение их чувствительности и селективности, а также создание и совершенствование различных типов компьютерного обеспечения для спектрофотометров, позволяющих максимально автоматизировать процесс анализа.