Существует два способа культивирования микроорганизмов — продуцентов ферментов: поверхностный и глубинный.

Первый способ, применяемый для культивирования микро­скопических грибов, характеризуется развитием мицелия на по­верхности твердого или жидкого субстрата. На жидком субстрате образуется пленка мицелия, продуцирующего не только амило­литические ферменты, но и органические кислоты, инактиви-рующие их, поэтому используют твердые субстраты с развитой поверхностью — пшеничные отруби, дробину барды, картофель­ную мезгу и др.

Максимальная активность ферментов достигается при культи­вировании грибов на пшеничных отрубях. Дробина барды бедна питательными веществами, и активность ферментов в культурах грибов, выращенных на ней, в 4...5 раз ниже, чем на отрубях. Зрелая культура грибов вследствие обволакивания частиц отру­бей мицелием имеет вид плотной войлокообразной массы.

При поверхностном культивировании пшеничные отруби должны быть увлажнены и простерилизованы. В стерильных ус­ловиях готовят посевную культуру, но выращивают грибы в не­стерильных условиях в кюветах, устанавливаемых в негерметич­ных растильных камерах. Теплоту, выделяющуюся в процессе роста грибов, удаляют продуванием через растильную камеру стерильного кондиционированного воздуха.

Поверхностный способ выращивания микроскопических гри­бов имеет ряд преимуществ. Так как во время роста гриба отруби не перемешиваются, посторонние микроорганизмы не распро­страняются по всей их массе и вызывают лишь незначительное местное инфицирование, которое, как правило, не влияет на активность ферментов. Это, однако, не исключает необходимос­ти тщательной стерилизации воздуха, среды и оборудования. Культуру на отрубях высушивают до содержания влаги 10... 11 %. В таком виде она может храниться продолжительное время без значительной потери активности. Это позволяет организовать централизованное снабжение спиртовых заводов сухой культурой микроскопических грибов, что является одним из преимуществ поверхностного способа выращивания.

Недостаток поверхностного способа — необходимость уста­навливать множество кювет, работу с которыми трудно механи­зировать. Себестоимость культуры гриба-продуцента высока,

причем в основном из-за затраты большого количества ручного труда. Механизация процесса выращивания возможна путем со­здания непрерывнодействующих установок или бескюветных ап­паратов с вертикальным толстым слоем питательной среды и интенсивным продуванием воздуха через этот слой.

Глубинную культуру микроорганизмов выращивают на жид­кой питательной среде при энергичной аэрации в герметически закрытых аппаратах и в стерильных условиях. Процесс полнос­тью механизирован. Стерильность глубинной культуры микроор­ганизма — продуцента ферментов положительно отражается на результатах сбраживания сусла дрожжами.

ПОВЕРХНОСТНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРОСКОПИЧЕСКИХ           

ГРИБОВ

Питательные среды. При поверхностном культивировании твердой средой обычно служат пшеничные отруби, содержащие в достаточных количествах все вещества, необходимые для пита­ния грибов. Лучшие результаты достигаются при содержании не менее 16 % крахмала в отрубях или в другой питательной среде.

Получение посевного материала. Для засева производственной питательной среды может быть использован посевной материал трех видов: споры, мицелий и спороносящая культура, выращен­ная на твердой питательной среде.

Споровый материал готовят поверхностным культивировани­ем гриба на твердой или жидкой питательной среде в специаль­ных аппаратах с кюветами. В первом случае гриб выращивают в пробирке на косом агаре до обильного образования спор, затем спорами засевают колбы со стерильными пшеничными отрубя­ми, наконец, спороносящую культуру передают в специальный аппарат. По окончании спорообразования в этом аппарате отби­рают споры посредством специального вибросепаратора при тщательной аспирации. Споры фасуют в полиэтиленовые ме­шочки, стеклянные или дюралюминиевые банки, в которых они могут сохраняться при температуре от 8 до 24 °С около 1,5 лет.

Во втором случае из спор, собранных в пробирке с косым агаром, готовят водную суспензию и ею засевают жидкую пита­тельную среду, которую направляют в растильный аппарат. Из-под выросшей спороносящей пленки удаляют жидкую среду, пленку подсушивают, снимают с кювет, измельчают и упаковы­вают. Готовый споровый материал не содержит примеси среды и обладает высокой всхожестью (90...95 %), которая сохраняется свыше 3 лет.

Споры (конидии), полученные любым методом, обладают во­доотталкивающей способностью и почти не смачиваются водой. Это свойство приводит к неравномерности засева среды и, сле­довательно, к неодинаковой скорости роста культуры. Смачивае-

мость спор можно улучшить, если добавить в их водную суспен­зию 25...50 мг поверхностно-активного вещества, например ал-килбензолсульфата на 1 г спорового материала. При этом всхо­жесть спор остается без изменения.

Для сокращения длительности культивирования микроскопи­ческих грибов в производственных условиях можно применять предварительное проращивание спор в течение 7 ч в жидкой питательной среде до появления ростовых трубочек. При этом продолжительность лаг-фазы сокращается на 8...9 ч и увеличива­ется оборачиваемость растильных камер.

При использовании спорового материала упрощается техноло­гический процесс, появляется возможность более полно механи­зировать его, а также сократить площадь цеха чистой культуры. Централизованное производство спорового материала для груп­пы предприятий, работающих с данным штаммом гриба, выгод­но создать в одном специализированном цехе чистой культуры. Положительный опыт подобной организации имеется в произ­водстве лимонной кислоты биотехнологическим способом.

Исследователями б. ВНИИПрБ было предложено засевать производственную питательную среду мицелием, полученным глубинным культивированием гриба или бактерий в колбах на качалке. При высокой производительности предприятия целесо­образно выращивать посевной мицелий в небольших ферменте­рах, как это было предложено А. П. Левчиком и осуществлялось на Мичуринском экспериментальном ферментно-спиртовом за­воде.

На спиртовых заводах получило распространение приготовле­ние посевного материала в виде поверхностной культуры гриба на пшеничных отрубях, которое складывается из следующих двух операций:

1. выращивание спороносной культуры гриба в пробирках на сусло-агаре;

2. засев спорами пшеничных отрубей в колбах и выращивание культуры гриба.

Культуру получают из лаборатории чистых культур ВНИИПрБ. Исходная — музейная чистая культура хранится в холодильнике при температуре от 2 до 4 °С. Один раз в месяц пересевают споры музейной культуры из пробирки в пробирку с сусло-агаром с соблюдением правил проведения микробиологических работ. При этом первая засеянная пробирка является музейной, а остальные две-три пробирки используют для дальнейшего размножения. За­сеянные пробирки помещают в термостат при температуре 30 °С и выдерживают в нем в течение 4...6 сут.

При нормальном росте поверхность сусло-агара равномерно покрывается спороносящим мицелием. Культура гриба с плохим спороношением, медленно растущим мицелием, пушком вторич­ного роста в производство не допускается. Пробирки с вырос-

шей культурой вынимают из термостата и хранят в холодильни­ке. Перед посевом в колбы проверяют чистоту культуры высевом в чашки Петри и микроскопированием.

Чистая культура на сусло-агаре служит исходным материалом для размножения грибов на пшеничных отрубях в колбах. Отру­би смешивают с водопроводной водой в соотношении 1:0,7 и переносят в несколько колб по 10...20 г в каждую. Колбы закры­вают ватными пробками и стерилизуют в автоклаве при избыточ­ном давлении 0,15 МПа в течение 1 ч. После охлаждения до комнатной температуры в колбы вносят суспензию спор гриба, содержащую 150...200 тыс. спор в 1 мл. Для этого в пробирку с культурой гриба на сусло-агаре прибавляют 10 мл стерильной водопроводной воды и при помощи стерильной пипетки над огнем соскабливают конидии гриба. Полученную суспензию ис­пользуют для посева (2...2,5 % массы засеваемой среды или 0,4...0,5 мл на 10 г отрубей).

Выращивание ведут в термостате при температуре 30 °С в течение 4...5 сут. Одну из колб предназначают для дальнейшего размножения чистой культуры, остальные колбы хранят в холо­дильнике до последующего цикла. В колбу, используемую для размножения, вливают 50...60 мл стерильной водопроводной воды и над пламенем стерильной пипеткой тщательно переме­шивают.

Расход чистой культуры при пересеве из колбы в колбу или банку составляет 5... 10 % массы засеваемой среды.

Размножение посевного материала. Пшеничные отруби подго­тавливают так же, как и при получении чистой культуры. Отру­би, стерилизованные в бюксах под избыточным давлением 0,15 МПа в течение 1,5 ч, переносят на специальный стол, пред­варительно вымытый и продезинфицированный. Охлаждение от­рубей до температуры 40...42 "С проводят перемешиванием с со­блюдением правил микробиологической чистоты. Затем их засе­вают спорами из колбы с чистой культурой (расход культуры 0,5... 1 % массы отрубей). Суспензию спор готовят из расчета 1 часть культуры на 5 частей воды. Засеянные отруби распределя­ют по кюветам, предварительно простерилизованным при 120 °С в течение 2 ч, слоем толщиной 2...2,5 см. Кюветы сверху закры­вают крышкой, под которую подкладывают стерильную бумагу; на отверстие по центру крышки накладывают стерилизованную ватную подушку, после чего кюветы помещают в термостат на 18...24 ч при температуре 30...32 "С. В дальнейшем кюветы уста­навливают на стеллажи, расположенные в самой растильной ка­мере, и ведут выращивание при 24...28 °С в течение 3...4 сут. Выросшую культуру затем помещают в комнату подсушки и в воздушно-сухом состоянии передают на хранение в кладовую, температура в которой не должна превышать +8 °С, но не ниже 0°С.

Посевной материал, приготовленный описанным способом, представляет собой спороносную культуру гриба, содержащую не менее 0,7 млрд спор в 1 г, из которых 86...90 % способны к прорастанию. Посевной материал не должен содержать посто­ронней микрофлоры, подвергаться замораживанию, оттаиванию и увлажнению.

Производственное культивирование. Технологическая схема получения культуры микроскопических грибов в растильных ка­мерах на кюветах приведена на рис, 4. Этот способ связан с большими затратами ручного труда, однако пока применяется на заводах.

Пшеничные отруби ковшовым элеватором / подают на авто­матические весы 2, отсюда они поступают в загрузочный бункер 3, а из него — в стерилизатор 5. В этом аппарате отруби увлаж­няются водой, подаваемой через форсунки из бака 4 для сте­рильной воды. На 1 кг отрубей добавляют 0,2 л воды и 7...8 мл соляной кислоты относительной плотностью 1,19 или 2,7...3,0 мл серной кислоты плотностью 1,84. Отруби стерилизуют острым паром при температуре 103... 105 "С (давление 0,07 МПа) в тече­ние 1...1,5 ч, периодически включая мешалку. По окончании стерилизации влажность отрубей доводят до 58...60 %, охлаждают их до 40...42 °С и затем вносят культуру гриба, полученную в отделении чистых культур.

Расход посевного подсушенного материала составляет 0,5...0,6 % массы отрубей. Посевной материал вводят в виде водной суспензии, приготовляемой из культуры гриба в 5... 10-кратном количестве кипяченой воды.

Рис. 4. Технологическая схема получения культуры микроскопических грибов в

Камерах на кюветах

Засеянную среду тщательно перемешивают в течение 15...20 мин, выгружают на раскладочный стол 6 и распределяют по кюветам. Наполненные кюветы ставят в этажерки 7, перево­зят их на тележках в растильную камеру 8, в которой поддержи­вают температуру 30...32 °С в течение 12... 16 ч (до начала интен­сивного роста). В дальнейшем из кондиционера 9 в камеру пода­ют вентилятором кондиционированный воздух температурой 26...28 °С и относительной влажностью 96...100 %. К концу вы­ращивания культуры температуру снижают до 24...26 °С. Общая продолжительность выращивания 36...42 ч. В тех случаях, когда использование готовой культуры для осахаривания разваренной массы задерживается более чем на 2 ч, ее высушивают до влаж­ности 18...20 %.

При необходимости транспортировки на дальние расстояния культуру гриба дробят на шнеке-дробилке 10 и дезинтеграторе 11 до получения частиц размером не более 10 мм и высушивают в сушилке 18 теплым воздухом до содержания влаги не более 10... 12 %. Воздух нагревают в калорифере 20 и подают в сушилку вентилятором 19. Отработавший воздух удаляют вентилятором 17 и выбрасывают в атмосферу через циклон 14. Высушенную культу­ру шнеком 16 подают на весы 75 для фасования. Сюда же подают­ся уловленные в циклоне частички культуры, унесенные воздухом. Освободившиеся кюветы проходят через мойку 12, обеспложива­ются в стерилизаторе 13 и возвращаются под загрузку.

Готовую культуру гриба упаковывают в бумажные крафт-мешки. Каждый мешок снабжают этикеткой или биркой с указа­нием завода-изготовителя, наименования продукта, даты выпус­ка, номера партии, активности ферментов и массы. Хранят куль­туру в сухом помещении на деревянных стеллажах.

Предложены технологические схемы производства поверх­ностных культур плесневых грибов с использованием механизи­рованных растильных установок: с вертикальными каналами (ус­тановка была смонтирована на Мичуринском эксперименталь­ном заводе и может быть использована на предприятиях средней мощности — до 2 т культуры гриба в сутки); непрерывнодейст-вующей конвейерно-пластинчатой, предназначенной для специа­лизированных ферментных предприятий мощностью более 2 т культуры в сутки.

ГЛУБИННОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ

При глубинном культивировании микроорганизмы развивают­ся во всем объеме жидкой питательной среды. Так как подав­ляющее большинство продуцентов ферментов — строгие аэробы, среду интенсивно аэрируют. В микроорганизмах протекают два связанных процесса — синтез биомассы и синтез ферментов.

Питательные среды. Для глубинного культивирования используют жидкие среды, содержащие твердые компоненты. При ра­боте с комплексными средами, основанными на естественном сырье с добавлением отрубей, ростков, кукурузного жмыха, глю-тена, свекловичного жома, спиртовой барды, следят за тем, чтобы не было крупных комочков, так как они затрудняют сте­рилизацию и могут привести к закупорке коммуникаций. Поэто­му перед смешением твердых компонентов необходимо прово­дить их просеивание или грубую фильтрацию (например, зерно-картофельной барды).

Жидкую часть питательной среды (воду или фильтрат барды) обогащают питательными солями, гидролизатами белков, амино­кислотами, источниками витаминов, различными углеводами. Содержание сухих веществ в жидких средах может колебаться от 1,5 до 20 % в зависимости от продуцента и принятого режима культивирования.

В научно-исследовательских организациях постоянно прово­дится работа по улучшению эффективности производства фер­ментных препаратов, в основном по повышению активности, зрелой культуры. Это достигается не только селекцией штаммов микроорганизмов, но и совершенствованием условий культиви­рования, в том числе и изменением состава питательной среды, поэтому приведенные среды могут подвергаться значительным изменениям при корректировании аэрации и других условий культивирования.

Получение и размножение посевного материала. Для засева производственной питательной среды при глубинном культиви­ровании посевной материал готовят глубинным или поверхност­ным способом. Вид посевного материала зависит от продуцента:

для грибов это вегетативная мицелиальная масса или споронося-щая поверхностная, для бактерий — молодая растущая культура на начальной стадии спорообразования.

Посевной материал получают постадийным увеличением массы культуры продуцента. При небольшой производительнос­ти цеха это сводится к одной или двум операциям, а для заводов большой производительности представляет собой многоступен­чатый процесс.

В связи с вводом штаммов микроскопического гриба Asp. awamori 466 или ВУД Т-2 усовершенствована и значительно упрощена схема приготовления спорового взамен вегетативного посевного материала. В простейшем виде она выглядит следую­щим образом. Пробирку с исходной культурой на агаризованной питательной среде пересевают водной суспензией в колбы со стерильными отрубями, которые выдерживают в термостате до полного созревания культуры. Из колб посевной материал в виде водной суспензии спор пересевается непосредственно в произ­водственный ферментер, минуя инокулятор. В зависимости от объема ферментера количество посевных колб увеличивают в 2..4 раза. Спорового посевного материала вполне хватает для того, чтобы вырастить достаточно активную культуру при обычной продолжительности процесса. При этом получаются большой выигрыш в трудоемкости операций и более надежная защита от инфекции, так как в 2 раза сокращаются число операций и продолжительность выращивания посевного материала.

Культивирование на всех стадиях должно проводиться при оптимальной температуре, аэрации и строго определенное время. Если возникают непредвиденные задержки в использовании, то

посевной материал охлаждают до 8... 10 °С и хранят не дольше 4 ч, иначе качество его может резко ухудшиться.

Посевной материал как на отдельных стадиях, так и готовый подвергают тщательному микробиологическому контролю. Он не должен быть инфицирован посторонней микрофлорой, в нем должно содержаться определенное количество спор или клеток на единицу массы, генетически заложенные в нем свойства про­дуцировать ферменты должны стойко сохраняться.

Производственное культивирование. Известны следующие спо­собы глубинного культивирования: периодический, непрерывно-циклический и непрерывно-проточный.

Периодический способ характеризуется несменяе­мостью питательной среды в ферментере, состав которой в про­цессе развития постепенно изменяется. Процесс протекает по-стадийно: в ферментер набирают питательную среду и задают посевной материал; после размножения микроорганизмов и на­копления продуктов их обмена зрелую культуру выгружают, а все оборудование, коммуникации и запорные устройства промыва­ют, а затем стерилизуют паром.

При непрерывноциклическом способе микро­организмы, расположенные на неподвижной насадке в фермен­тере, омываются средой, протекающей в замкнутом контуре, до полного потребления ими питательных веществ. После этого зрелую культуру выгружают, начиная с последнего, аппараты промывают, стерилизуют и цикл повторяют с последнего голов­ного ферментера. Богатая питательными веществами среда в ходе такой циклической ферментации постепенно истощается; по времени пребывания среды в зоне реакции этот процесс более продолжителен, чем периодический.

Непрерывно-проточный способ культивирова­ния микроорганизмов более совершенен. Суть его заключается в том, что микробная популяция развивается в проточной пита­тельной среде. Способ имеет две разновидности: гомогенно-не­прерывный и градиентно-непрерывный. В первом случае выра­щивание ведут в одном ферментере; при тщательном перемеши­вании среды и аэрации обеспечивается одинаковое состояние культуры во всем объеме жидкости. В ферментер при этом не­прерывно поступает свежая среда, а из него также непрерывно вытекает избыток зрелой культуральной жидкости.

Градиентно-непрерывное культивирование осуществляют в батарее ферментеров, соединенных переточными трубами. Засе­янная среда с большим содержанием углеводов и других ингре­диентов непрерывно перетекает из одного ферментера в другой и также непрерывно вытекает в виде готовой культуры.

Непрерывным культивированием в проточных средах можно выращивать микроорганизмы в условиях, оптимальных для их стадии развития. При этом такие важные факторы, как концент-

рация питательных веществ, количество продуктов обмена, рН, содержание растворенного кислорода, резко изменяющиеся при периодическом способе культивирования, поддерживаются по­стоянными на заданном уровне или изменяются по разработан­ной программе.

Способы непрерывного культивирования в производстве фер­ментных препаратов для спиртового производства еще находятся в стадии производственных испытаний. Поэтому, к сожалению, в настоящее время на заводах до сих пор применяют периоди­ческое культивирование микроорганизмов.