Репликация, сохранение и модификация генома

Генетическая программа клеточных организмов записана в нуклеотидной последовательности ДНК. Следовательно, для сохранения уникальных свойств организма необходимо точное воспроизведение этой последовательности в каждом последующем поколении. Е. coli, например, должна дуплицировать практически без ошибок полный геном размером 4*10⁶ нуклеотидных пар при образовании каждого последующего поколения; точно так же должны быть скопированы почти 4*10⁹ пар оснований в 23 парах хромосом человека при каждом акте деления клеток.

Одной из чудесных особенностей ДНК является то, что в ней закодирована информация о механизме ее собственного удвоения: одни гены кодируют ферменты, синтезирующие нуклеотидные предшественники ДНК, другие - белки, осуществляющие сборку активированных нуклеотидов в полинуклеотидные цепочки. Есть гены, координирующие процесс репликации с другими клеточными событиями, а также гены, кодирующие белки, которые упаковывают ДНК в хроматин. Еще одним необычным свойством ДНК является то, что она служит матрицей и определяет порядок, в котором нуклеотиды выстраиваются в новые нуклеотидные цепочки. Обладая одинаковым аппаратом синтеза, различные ДНК осуществляют образование только подобных себе реплик.

В генетической программе предусмотрены ферментативный механизм, который исправляет ошибки, иногда происходящие при репликации ДНК, и механизм репарации повреждений, затрагивающих основания или спиральную структуру при облучении рентгеновскими лучами и ультрафиолетовым светом или при воздействии различных химических агентов, а также механизм устранения дефектов, связанных с некоторыми заболеваниями. Генетическая программа обеспечивает создание геномных вариантов и возможность эволюционных изменений. Определенные гены кодируют белки, способствующие обмену цепями, принадлежащими разным молекулам ДНК, и тем самым созданию новых комбинаций генетического материала, передаваемых потомству. Известны белки, вызывающие геномные перестройки путем катализа транслокаций небольших сегментов или даже протяженных участков в пределах одной молекулы ДНК и между молекулами. С одной стороны, рекомбинации и транслокации подобного рода создают основу для эволюционных экспериментов, а с другой - некоторые перестройки могут быть причиной заболеваний. Как это ни странно, оптимальное функционирование некоторых генетических программ действительно зависит от специфических перестроек в ДНК.

Репликация ДНК

Б. Некоторые ДНК-содержащие вирусы используют для репликации обратную транскрипцию

Геном вируса гепатита В человека представлен кольцевой двухцепочечной ДНК с пробелами. Если вирус находится внутри клетки, то пробелы заполняются вирионной ДНК-полимеразой. Такая почти полноразмерная цепь ДНК играет роль матрицы, на которой синтезируется РНК. Длина этой РНК равна длине генома вируса, и она играет роль мРНК в процессе экспрессии вирусных белков и роль матрицы при обратной транскрипции с образованием дочерней вирусной ДНК. Аналогичный механизм реализуется и при репликации вируса мозаики цветной капусты и других вирусов растений.

Репарация ДНК

ДНК - это единственная макромолекула клетки, которая способна устранять повреждения, возникающие в ее структуре. Более того, в ней закодирована информация о механизмах самых разнообразных репарационных процессов. Комплементарное спаривание лежит в основе не только репликации ДНК, но и процесса восстановления исходной структуры ДНК при репарации повреждений, затрагивающих остов молекулы, модификаций того или иного основания или ошибочного спаривания при рекомбинации. Одновременное повреждение обеих цепей в одном месте и двухцепочечные разрывы часто оказываются летальными для ДНК, поскольку такие дефекты репарируются лишь в редких случаях.

Наиболее часто происходит разрыв гликозидных связей между пурином и дезоксирибозой N при повышении температуры. За сутки в клетке человека совершается от 5000 до 10000 актов депуринизации. Если не принимать никаких мер, то это приведет к нарушению репликации и экспрессии генов. Кроме того, остатки цитозина и аденина могут подвергаться спонтанному дезаминированию с образованием соответственно остатков урацила и гипоксантина; частота таких событий составляет примерно 100 на геном в сутки. Если подобные нарушения в ДНК не будут устранены до следующего раунда репликации, то они могут послужить источником мутаций.

Многие изменения в структуре ДНК происходят под действием химических веществ, присутствующих в окружающей среде. К таким веществам относятся алкилирующие агенты, которые модифицируют предпочтительно гуаниновые остатки; соединения, встраивающиеся между соседними парами оснований и приводящие к появлению вставок и делеций во время репликации; бифункциональные агенты, способные образовывать ковалентные сшивки между двумя цепями ДНК и блокировать их расхождение при репликации. Не менее разрушительными могут быть и физические воздействия. Поглощение тиминовым или цитозиновым основанием ультрафиолетового света может приводить к образованию циклобутановых димеров между соседними пиримидинами; под действием ионизирующей радиации, например космических лучей, могут образовываться высоко реакционноспособные свободные радикалы, оказывающие на ДНК самые разнообразные воздействия; при облучении рентгеновскими лучами в медицинских целях в ДНК могут возникать одно - и двухцепочечные разрывы, а также другие повреждения, характерные для воздействия на ДНК свободных радикалов.

Как же ДНК противостоит таким разрушительным воздействиям? Благодаря какому механизму восстанавливается нормальная структура нуклеотидов и их последовательность прежде, чем эффект воздействия закрепится и проявится в виде мутации?

Известны два основных типа репарационных процессов:

1) непосредственное исправление модификаций или неправильных спариваний, не требующее репликации для восстановления исходной структуры;

2) удаление нуклеотидов, окружающих ошибочно спаренные или измененные пары оснований, и ре-синтез этого участка путем репликации.

В. Значение репарации ДНК

У клеток в процессе эволюции выработался сложный механизм устранения повреждений, возникающих в ДНК под действием самых разнообразных химических и физических факторов, а также вследствие ошибок при репликации или рекомбинации. И это вполне понятно: большая часть повреждений блокирует передачу генетической информации последующему поколению, а остальные, если их не устранить, сохранятся в геномах потомков и приведут к драматическим изменениям в молекулах белков, а том числе и ферментов, необходимых для поддержания жизнедеятельности клетки. При повреждении определенных звеньев системы репарации клетки становятся особенно уязвимыми для некоторых химических и физических агентов. Например, клетки Е. coli, у которых нарушена система внесения разрывов в ДНК при выщеплении тиминовых димеров, очень чувствительны к УФ-свету. Клетки, неспособные осуществить ту или иную N-гликозилазную реакцию, гораздо больше, чем нормальные, подвержены мутагенному или летальному эффекту алкилирующих агентов или ионизирующей радиации. У клеток Е. coli, дефектных по Pol I, существенно снижена выживаемость при облучении низкими дозами УФ-света.

У представителя низших эукариот Saccharomyces cerevisiae имеется по крайней мере пять генов, кодирующих белки, которые участвуют во внесении разрывов в УФ-облученную ДНК. Нарушение только в одном из этих пяти RAD-генов приводит к тому, что клетки утрачивают способность к внесению разрывов в ДНК и, следовательно, к удалению пиримидиновых димеров. У дрожжей существуют также мутанты с нарушенной способностью к удалению сшивок между цепями, хотя элиминация УФ-индуцированных повреждений проходит нормально. Это предполагает, что у дрожжей, как и у человека, для удаления поперечных сшивок, а возможно, и для исправления множества других химических модификаций в ДНК существуют специфические, весьма сложные механизмы репарации.

Люди, страдающие пигментной ксеродермой, очень чувствительны к ультрафиолетовому свету, и у них развиваются разные формы рака кожи даже при очень слабом воздействии солнечного света. Клетки таких людей несут мутацию, сходную с RAD-мутацией дрожжей и проявляющуюся в том, что у них нарушена способность к выщеплению пиримидиновых димеров из УФ-облученной ДНК. Заболевание может быть обусловлено мутацией в одном из по крайней мере девяти генов, что говорит о достаточно сложном механизме репарации ДНК, содержащей тиминовые димеры, у человека. Как правило, заболевание бывает связано с неспособностью к выщеплению тиминовых димеров. Если к облученным клеткам в культуре добавить фермент, обладающий тиминдимергликозилазной и АР-эндонуклеазной активностями, то УФ-повреждения могут быть устранены.

Рекомбинация ДНК

Генетическая рекомбинация включает несколько связанных между собой процессов, в результате которых в клетках или организмах, где они происходят, создаются новые комбинации элементов носителей генетической информации. Рекомбинация между близко расположенными гомологичными хромосомами приводит к интенсивной перетасовке отцовских и материнских генов в ходе мейоза и тем самым создает предпосылки для эволюционной проверки новых комбинаций этих генов в потомстве. Как правило, рекомбинационные события, происходящие в соматических клетках либо во время репликации ДНК, либо после нее и проявляющиеся в виде обмена сестринских хроматид, не приводят к изменению генотипа или фенотипа клетки. Однако нередко они порождают различные геномные перестройки. Это, например, утрата, приобретение или амплификация генетических элементов и установление новых взаимосвязей между уже имеющимися, но по-новому расположенными элементами.

Если использовать молекулярные термины, то можно сказать, что генетическая рекомбинация состоит в образовании ковалентных связей между нуклеотидными последовательностями из разных областей одной и той же или разных молекул ДНК.

Все клетки и многие вирусы содержат информацию о синтезе ферментов, предназначенных не только для репарации повреждений в собственной ДНК, но и ферментов, осуществляющих рекомбинацию. На самом деле некоторые ферменты, участвующие в репликации и репарации ДНК, играют ключевую роль и при рекомбинации. В этом разделе мы рассмотрим механизмы некоторых рекомбинационных процессов и ферменты, которые их катализируют. Особое внимание будет обращено на рекомбинацию у бактерий и фагов, поскольку у них эти процессы довольно хорошо изучены. Несмотря на то что генетические и морфологические аспекты рекомбинации в эукариотических клетках известны, на молекулярном уровне здесь многое остается неясным.

А. Типы рекомбинации

Существуют три типа рекомбинации: общая, или гомологичная, сайт-специфическая и случайная, или негомологичная.

Общая рекомбинация. Общая рекомбинация происходит, как правило, между протяженными участками идентичных или гомологичных нуклеотидных последовательностей. Ее часто называют гомологичной рекомбинацией или кроссинговером. При общей рекомбинации происходит разрыв двух гомологичных участков ДНК, и каждый из концов одного сегмента соединяется с соответствующими концами другого таким образом, что обе образующиеся молекулы содержат разные фрагменты обеих участвующих в рекомбинации ДНК. На самом деле сайты, по которым происходят разрыв и воссоединение каждой из двух цепей, очень часто не совпадают.

Обычно общая рекомбинация происходит между гомологичными и аллельными участками разных молекул ДНК, но она может произойти и между гомологичными, но неаллельными областями ре-комбинирующих молекул. В этом случае один из продуктов рекомбинации утрачивает часть ДНК, а другой приобретает "лишний" сегмент. Такой процесс получил название неравного кроссинговера. Иногда рекомбинация происходит между неаллельными участками одной и той же хромосомы с соответствующей потерей области, лежащей между сайтами рекомбинации. В отличие от уже рассмотренных случаев некоторые рекомбинационные события нереципрокны; как следствие, один из образовавшихся продуктов идентичен одной из исходных молекул, а другой отличается от обоих партнеров. Такой процесс часто называется генной конверсией.

Сайт-специфическая рекомбинация. Рекомбинация называется сайт-специфической, если сайты разрыва и воссоединения в двух рекомбинирующих молекулах или двух фрагментах одной и той же молекулы ДНК находятся в пределах довольно коротких специфических гомологичных нуклеотидных последовательностей - как правило, не более 25 нуклеотидов. Такие короткие последовательности может иметь только один из партнеров или оба. В качестве примера первого варианта можно привести транспозиции некоторых мобильных элементов у эу - и прокариот, а второго - процесс интеграции-выщепления ДНК фага X из хромосомы Е. coli. С помощью сайт-специфической рекомбинации происходят запрограммированные перестройки хромосомной ДНК при смене типов спаривания у дрожжей; она ответственна также за разнообразие антител. По-видимому, общая рекомбинация между любыми парами гомологичных последовательностей осуществляется с помощью одного и того же комплекса ферментов; с другой стороны, для каждого случая сайт-специфической рекомбинации необходим свой набор ферментов. Негомологичная рекомбинация. Рекомбинация между негомологичными нуклеотидными последовательностями происходит в клетках прокариот и дрожжей достаточно редко, а в клетках млекопитающих - весьма часто. К негомологичной рекомбинации можно отнести процесс случайного встраивания вирусной или плазмидной ДНК в ДНК клеток животных, в результате чего в реплицирующихся геномах паповавирусов появляется множество делеций и дупликаций. Концы разорванной ДНК могут соединиться, даже если они негомологичны. В некоторых случаях рекомбинация происходит между последовательностями, содержащими несколько гомологичных пар оснований, или между короткими частично гомологичными участками. Но, как правило, рекомбинирующие сегменты не имеют гомологичных последовательностей.

Репликация

Образование РНК-содержащих вирусов происходит путем репликации их РНК, тогда как все клеточные РНК образуются в результате транскрипции ДНК. Здесь мы рассмотрим лишь процесс репликации вирусной РНК как таковой, не касаясь связи репликации с жизненным циклом соответствующих вирусов.

За исключением ретровирусов, репликация РНК в основном повторяет процесс репликации ДНК. Цепи РНК также удлиняются на один нуклеотид за один акт в направлении 5'->3' путем присоединения рибонуклеотидтрифосфата к 3'-ОН-концу растущей цепи. Как и при репликации ДНК, порядок расположения нуклеотидов определяется комплементарным копированием матрицы, в данном случае обязательно цепи РНК. Ферменты, осуществляющие этот процесс, называются РНК-зависимыми репликазами.

РНК бактериальных вирусов R17 и MS2, а также полиовирусов и вируса Синдбис, инфицирующих животных, всегда обозначается знаком, поскольку последовательность их РНК-геномов идентична последовательности мРНК. Таким образом, геном инфицирующего вируса может служить в качестве мРНК и содержит информацию о синтезе некоторых, если не всех, вирусных белков. Специфическая репликаза, кодируемая геномом вируса и образующаяся вскоре после инфекции, связывается с одним или несколькими белками клетки-хозяина и инициирует процесс копирования - цепи с ее 3'-конца с образованием полной - цепи, ассоциированной с - цепью-матрицей. Затем та же репликаза, возможно вместе с другими вирусными белками, синтезирует множество копий - цепи РНК, используя новосинтезированную цепь в качестве матрицы. С единственной - матричной цепи РНК синтезируется одновременно несколько новых - цепей. У многих вирусов копирование - или - цепей инициируется путем спаривания рибонуклеозидтрифосфата с первым нуклеотидом на 3'-конце матричной цепи.

Цепь РНК полиовируса реплицируется способом, аналогичным представленному, но его геномная РНК имеет одну особенность - к ее 5'-концу с помощью фосфодиэфирной связи присоединен белок через тирозиновый остаток. У - цепи, синтезируемой в первом раунде репликации, этот белок отсутствует. Однако все цепи, образующиеся на цепи как на матрице, содержат 5'-концевой белок, даже когда их длина еще очень мала. Это позволяет предположить, что репликаза полиовирусов использует гидроксильную группу тирозина в качестве праймера при инициации новых - цепей, в то время как - цепи фермент может инициировать de novo.

Геном некоторых вирусов представлен одной цепью РНК, нуклеотидная последовательность которой комплементарна, а не идентична последовательности мРНК. Такие геномы обозначают знаком. Существуют также вирусы, геном которых состоит из множественных - цепей РНК, при этом каждый такой сегмент соответствует одному или двум вирусным генам. Если геном вируса представлен одной или более - цепями РНК, то в самом вирионе содержится комплекс геномной РНК со специфической репликазой. После проникновения в клетку комплекс активируется, и на - цепях как на матрицах синтезируются - цепи. Новосинтезированные - цепи играют роль мРНК для синтеза новых или дополнительных репликационных белков и роль матрицы при синтезе дочерних - цепей.

Геном некоторых вирусов представлен двухцепочечной РНК, содержащей и - , и - цепи. Репликация у таких вирусов также инициируется ферментами, содержащимися в самом вирионе. Эти ферменты копируют - цепь дуплекса РНК консервативным путем - цепи отделяются). Белки-репликазы, транслируемые с этих - цепей мРНК, синтезируют затем комплементарные - цепи, которые, объединяясь с - цепями, образуют дочерние двухцепочечные РНК вируса.

Имеющиеся данные о структуре и функции РНК-репликаз весьма ограниченны. Наиболее детально изучена РНК-репликаза, синтезируемая РНК-содержащим колифагом Qp. Она состоит из четырех идентичных полипептидов, причем только один из них кодируется вирусным геномом. Этот полипептид не способен реплицировать - цепи вируса, он может катализировать только ограниченную реакцию присоединения рибонуклеотидов. Остальные три белка, входящие в состав РНК-репликазы фага QP, являются компонентами хозяйского аппарата синтеза белка, и их точная функция в процессе репликации РНК неизвестна. Инициация и репликация, осуществляемые РНК-репликазой, кодируемой вирусами животных, также зависит от активности белков, образуемых клеткой-хозяином. Отличительная особенность РНК-репликаз состоит в их необычной способности специфически узнавать нуклеотидные последовательности на 3'-концах как и цепей, что гарантирует инициацию синтеза новых цепей.

Репликация, сохранение и модификация генома

Генетическая программа клеточных организмов записана в нуклеотидной последовательности ДНК. Следовательно, для сохранения уникальных свойств организма необходимо точное воспроизведение этой последовательности в каждом последующем поколении. Е. coli, например, должна дуплицировать практически без ошибок полный геном размером 4*10⁶ нуклеотидных пар при образовании каждого последующего поколения; точно так же должны быть скопированы почти 4*10⁹ пар оснований в 23 парах хромосом человека при каждом акте деления клеток.

Одной из чудесных особенностей ДНК является то, что в ней закодирована информация о механизме ее собственного удвоения: одни гены кодируют ферменты, синтезирующие нуклеотидные предшественники ДНК, другие - белки, осуществляющие сборку активированных нуклеотидов в полинуклеотидные цепочки. Есть гены, координирующие процесс репликации с другими клеточными событиями, а также гены, кодирующие белки, которые упаковывают ДНК в хроматин. Еще одним необычным свойством ДНК является то, что она служит матрицей и определяет порядок, в котором нуклеотиды выстраиваются в новые нуклеотидные цепочки. Обладая одинаковым аппаратом синтеза, различные ДНК осуществляют образование только подобных себе реплик.

В генетической программе предусмотрены ферментативный механизм, который исправляет ошибки, иногда происходящие при репликации ДНК, и механизм репарации повреждений, затрагивающих основания или спиральную структуру при облучении рентгеновскими лучами и ультрафиолетовым светом или при воздействии различных химических агентов, а также механизм устранения дефектов, связанных с некоторыми заболеваниями. Генетическая программа обеспечивает создание геномных вариантов и возможность эволюционных изменений. Определенные гены кодируют белки, способствующие обмену цепями, принадлежащими разным молекулам ДНК, и тем самым созданию новых комбинаций генетического материала, передаваемых потомству. Известны белки, вызывающие геномные перестройки путем катализа транслокаций небольших сегментов или даже протяженных участков в пределах одной молекулы ДНК и между молекулами. С одной стороны, рекомбинации и транслокации подобного рода создают основу для эволюционных экспериментов, а с другой - некоторые перестройки могут быть причиной заболеваний. Как это ни странно, оптимальное функционирование некоторых генетических программ действительно зависит от специфических перестроек в ДНК.

Репликация ДНК