Сперматозоиды являются природным вектором, доставляющим ДНК в клетку. Использование спермиев в качестве переносчиков одной ДНК рассматривается как один из перспективных методов генетической модификации животных. В опытах Lavitrano (1989) 30% мышей полученных после оплодотворения обработанной ДНК спермой, оказались трансгенными и передавали трансген по наследству.
Многочисленные попытки в других лабораториях неуспешными. Анализ 1300 мышей, родившихся in vitro обработанной ДНК спермой, не выявил трансген ни у одной из исследованных особей [Brinster, 1989), Недавнее исследования показали, что при применении метода переноса ДНК посредством сперматазоидов в одной и той же лаборатории дае пра использовании одинаковой схемы исследований могут быть получены противоречивые результаты [Maiore et al, 1998]. Это позволяет предположить, что встраивание ДНК происходит только на определенной стадии клеточного цикла. Однако до настоящего времени не установлен механизм интеграции экзогенной ДНК в геном сперматозоидов.
Huguet и Esponda [1998] исследовали способность сперматозоидов поглощать линейную ДНК in vitro и in vivo. В опытах in vitro отмытые придатковые сперматозоиды инкубировали 2 часа с линейной ДНК. ДНК инъецировали в проксимальную область семенных канальцев, после чего через 6 часов извлекали сперматозоиды. Присутствие чужеродной ДНК было показано у 60-70% сперматозоидов. Сперматозоиды способны поглощать ДНК, аккумулировать ее в ядре. Секркты придатков и семенных канальцев не блокируют этот процесс.
Для повышения эффективности связывания ДНК со сперматозоидами используют различные методы: ДНК-липосомные комплексы [Bachiller et al.. 1991], инъекцию в семенники [Sato et al.. 1994], непосредственную инъекцию в семенные канальцы [Kim et al.. 1997] и придатки [Huguet и Esponda, 1998], инъекцию в семенные канальцы с последующей электропорацией [Yamazaki et al.. 1998], ко-инъекцию головок спермиев и ДНК в ооциты [Perry et al. 1999]. Также было показано, что экзогенная ДНК может быть эффективно доставлена в ооциты микроинъецированными сперматозоидами.
Большое внимание в последнее время привлекают манипуляции со стволовыми клетками семенников-сперматогониями [Brinster, Nagano. 1998]. Была продемонстрирована возможность переноса сперматогониев от одного самца другому как у животных одного вида (Avarbock, 1994; Brinster и Zimmermann. 1994), так и между двумя видами.
После пересадки половых клеток из семенников самца мыши в семенники другого самца, до 80% потомства происходило из сперматозоидов самца-донора. Была доказана возможность успешного протекания сперматогенеза после пересадки криоконсервированных клеток семенника и после их длительного консервирования.пересадке в семенники мышей клеток из семенников поздних стадий сперматогенеза половых клеток доноров выявлено не было /Dobnnski et al., 1999].
Успешное длительное культивирование половых клеток животных in uru делает возможным проведение трансформации сперматогониев экзогенной ДНК с последующей селекцией. Nagano с соавторами /2000] сообщили об успешном введении экзогенной ДНК в сперматогонии т vitro и in vivo посредством ретровирусной системы доставки. Экспрессия ретровирусной генной конструкции, включающей lacZ, наблюдалась в семенниках более 6 месяцев. Анализ показал, что по крайней мере 1 из 300 стволовых клеток семенников содержали трансген.
В сочетании с пересадкой трансформированных половых клеток в семенники реципиентов и успешным протеканием сперматогенеза подход может быть использован для получения трансгенного потомства.
Не смотря на хорошие результаты в использовании сперматозоидов для получения трансгенных мышей, а так же отдельные успешные попытки получения трансгенных свиней и КРС [Gandolfl et al, 1989, Schelander et al, 1995, Sperandio et al, 1996], каких-либо значительных успехов в получении трансгенных сельскохозяйственных животных с помощью трансформированных сперматогониев и спермиев до настоящего времени достигнуто не было. Достижения в использовании трансгенных технологий.
Год | Событие | Автор |
1971 | Доставка чужеродной ДНК в ооциты кролика сперматозоидами | Bracket |
1974 | Получение трансгенных мышей с помощью вирусных векторов | Jaenish, Mintz |
1976 | Передача трансгена по наследству | Jaenish |
1980 | Получение трансгенных мышей микроинъекцией | Gordon |
1981 | Получение стволовых клеток | Ewans, Kaufman, Martin |
1984 | Эмбриональные химеры из клеток тератокарциномы | Bradley |
1985 | Получение трансгенных сельскохозяйственных животных | Brem, Hammer |
1986 | Эмбриональные химеры с использованием ЭСК Получение овец посредством пересадки ядер | Gossler, Willadsen |
1987 | Гомологичная рекомбинация в ЭСК Получение КРС методом пересадки ядер | Thomas, Capeccha Brather |
1988 | Получение кроликов методом пересадки ядер | Slice и Robl |
1989 | Генный таргетинг у мышей Получение трансгенных мышей и свиней с помощью спермиев в качестве векторов Получение трансгенного КРС методом микроинъекции Получение свиней методом пересадки ядер | Thompson el al., Lavitrano el at.,Gandolfi et al. Roschlau el al., Prather et al., |
1995 | Получение трансгенного КРС с помощью спермиев | Schelander et al |
1996 | Получение овец методом пересадки ядер культивируемых эмбриональных клеток Получение ЭСК приматов | Campbell Thomson |
1997 | Получение овец методом пересадки ядер фетальных клеток и соматических клеток взрослого животного Получение трансгенных овец методом пересадки ядер трансформированных культивируемых клеток Получение химерных трансгенных свиней, с использованием ПЗК | Wilmutetal, Schnieke Piedrahita |
1998 | Получение трансгенного КРС методом пересадки ядер трансформированных фетальных фибробластов Получение трансгенного КРС с использованием псевдотипных ретровирусных векторов Получение ЭСК из бластоцист человека Получение мышей методом инъекции в цитоплазму ядер кумулюсных клеток Получение КРС методом пересадки ядер дифференцированных клеток | Cibelli Chan Thomson Wakayama Kato |
1999 | Получение трансгенных мышей методом коинъекции ооцитов спермиями и экзогенной ДНК | Perry |
2000 | Получение свиней методом пересадки ядер соматических клеток (клетки гранулезы) | Polejaeva |
Дата: 2019-07-24, просмотров: 308.