В даний час для біосинтезу лимонної кислоти в якості основної сировини широко використовують мелясу - відходи цукрової промисловості. У залежності від вихідного матеріалу розрізняють бурякову, очеретяну, цитрусову та інші види меляси. На міжнародному ринку щорічно продається 30-35 млн. тонн цієї сировини. Хоча меляса в основному використовується для кормових цілей, її широко застосовують також у мікробіологічній промисловості.

Бурякова меляса характеризується високим вмістом цукрів (46-55%), з яких переважає сахароза. Меляса має складний та непостійний хімічний склад. Вона містить колоїди, органічні кислоти, вітаміни, білки і вільні амінокислоти, складний спектр мінеральних речовин. З нелетких органічних кислот в мелясі можуть присутні,%: лимонна - 0,01-0,5; глюконова - 0,5-1,0; яблучна - 0,1-0,5; бурштинова - 0,1-0,7.

Добре зброджувана меляса повинна містити не більше 1% інвертного цукру і не більше 1% СаО і 0,06,% сірчистого газу (додається в мелясу в якості консервуючого агента) при загальному вмісті сухих речовин не менше 75% і цукрів не менше 46,% при невисокому вмісті живих мікроорганізмів.

У золі бурякової меляси багато калію, магнію, заліза, але відносно мало фосфору.

Хімічний склад меляси залежить від кліматичних і грунтових умов вирощування цукрових буряків, застосовуваних мінеральних добрив, часу збирання врожаю (пізні терміни збирання негативно впливають на якість меляси), технологічних нюансів переробки цукрових буряків, умов транспортування та зберігання меляси.

Виробництво меляси пов'язано з сезонними доставками сировини. У виробництві лимонної кислоти найкращі результати дає зріла, витримана меляса. Важливе значення мають тривалість зберігання меляси та наявність герметично закритих ємностей - мелясосховищ з пневматичним перемішуванням (для запобігання розшарування), насосами, пристроями для подачі і забору меляси з різних горизонтальних сховищ.

В останнє десятиліття якість меляси погіршується під впливом ряду додаткових чинників, пов'язаних з технічним прогресом. Широко застосовувані в сільському господарстві отрутохімікати і мінеральні добрива можуть залишати певні негативні сліди в сільськогосподарській продукції, зокрема в мелясі, де виявлені інсектициди, наприклад фосфорорганічний інсектицид малатілон (до 90 мг на 1 кг меляси), який надає інгібуючий вплив на біосинтез лимонної кислоти.

У мелясі виявлено присутність деяких фунгіцидів (трилон, мертрілан та ін) Дані про вплив фунгіцидів на біосинтез лимонної кислоти неоднозначні. Деякі автори стверждують, що ряд фунгіцидів пригнічує активність ферментів ізоцітрат-і сукцинатдегідрогенази і тим самим сприяє біосинтезу лимонної кислоти, в усякому разі у диких культур Aspergillus niger. За даними інших авторів, фунгціди негативно впливають на ацидогенез.

Виявлено пригнічення синтезу білка в клітинах Aspergillus niger під дією ртутьорганічного фунгіциду мертрілана. У результаті його впливу на ферменти циклу трикарбонових кислот (зокрема на малат-, ізоцітрат-і сукцинатдегідрогенази) різко знижуються інтенсивність дихання клітин та активність термінальних оксидоредуктаз, особливо цитохромоксидази. Фунгіцид трілан (4,5,6-тріхлорбензоксазолідон) також негативно впливає на метаболізм мікроміцета Aspergillus niger, але механізм його впливу інший.

Всі досліджені фунгіциди пригнічують інтенсивність дихання, гальмують синтез білка, порушують проникність цитоплазматичних мембран.

У мелясі нерідко виявляється присутність детергентов. Їх вплив на мікроорганізми не досить добре вивчено. Встановлено зміну проникності клітинної мембрани Aspergillus niger і як наслідок - підвищена гідроксилазна активність культури.

Спосіб культивування

Успіхи глибинної ферментації у виробництві антибіотиків спонукали виробників лимонної кислоти шукати шляхи глибинного культивування її продуцентів. У СРСР першою глибинне культивування продуцентів лимонної кислоти освоїла група дослідників під керівництвом Г.І. Журавського в 50-і рр., застосовуючи синтетичні сахарозні середовища і спеціально селекційно виведений для глибинного культивування штам Aspergillus niger. В якості ж сировини для глибинної ферментації лимонної кислоти може бути використаний широкий набір природних субстратів: меляса, глюкоза, сахароза, рідкі парафіни та інші джерела вуглецю.

Технологія глибинного культивування продуцентів лимонної кислоти представляє собою явно виражений двоступінчастий процес. Перший ступінь включає вирощування посівного матеріалу з конідіоспор в посівному середовищі (на гойдалці і в посівному апараті) при 32-33°С в умовах інтенсивної аерації (0,8-1,0 об'єму повітря на 1 об'єм середовища в хвилину) і при безперервному перемешуванні середовища. Тривалість культивування на стадії вирощування посівного матеріалу - 2 доби (1 добу - на качалка, 1 - на посівному апараті).

Сказане принципово не виключає безпосереднього застосування конідіоспор як посівний матеріал для основної ферментації, проте це суттєво подовжує цикл ферментації: з 7-8 до 12-13 діб.

Основну ферментацію в глибинних умовах здійснюють у виробничому біореакторі при коефіцієнті його заповнення 0,75-0,80 і кількості посівного матеріалу 5-8% від об'єму ферментного середовища. Початкова концентрація цукрів - 10-14%, часто застосовують підживлення свіжим середовищем, особливо в разі застосування мелясних середовищ. Регуляція рН середовища не потрібна, але оскільки лимонна кислота дуже корозійна і для ферментаційного обладнання необхідна стійка до корозії сталь, то для пом'якшення практикують підлужнення ферментного субстрату до рН 3,8-4,2. Процес ферментації має риси двох фаз, або стадій: формування біомаси та кислотоутворення.

Для фази накопичення біомаси характерно об'єднання молодого міцелію в кулясті агломерати, формування яких продовжуються до 70-80 год ферментації. Деяка частина гіфів залишається у вільному вигляді.

Під час інтенсивного росту потреба продуцента в молекулярному кисні складає до 1 кг на кожен кубометр ферментного субстрату на годину. У фазі біосинтезу лимонної кислоти потреба в кисні в деякій мірі знижується і складає 0,5-0,6 кг 0₂/м³-год. Для забезпечення масопередачі кисню в ферментний субстрат вводиться стерильне повітря в кількості 0,8-1,0 об'єму на 1 об'єм середовища в хвилину, одночасно за допомогою мішалки створюється циркуляція середовища зі швидкістю 1,2-1,5 м/с вздовж стінки ферментної установки. Насичення середовища киснем у початковій фазі ферментації має складати 20-25% від повного насичення, у фазі біосинтезу лимонної кислоти - 10-15%.

Температурні режими в ферментних субстратах диференційовані: у фазі росту біомаси - 32-33°С, у фазі кислотоутворення - 30-31°С.

Залежно від особливостей використовуваного мутанта Aspergillus niger застосовують різні варіанти технологічних режимів глибинної технології.