Проводят титрование медно-щелочного раствора с известным титром исследуемым раствором сахара без доступа воздуха в токе водяного пара. Титр медно-щелочного раствора устанавливают по глюкозе. Прибор для титрования состоит из внешнего сосуда - конической колбы / и внутреннего сосуда - эбулиостата 1 с впаянной в его боковую стенку трубкой, доходящей почти до дна сосуда. Суженный конец эбулиостата вставлен в колбу / на резиновой пробке и имеет отверстие для выхода пара 3. В резиновую пробку вставлена стеклянная трубка 4 для отвода избытка пара из колбы /. Струю пара регулируют винтовым зажимом на резиновой трубке, надетой на конец стеклянной трубки. Во время титрования верхний конец эбулиостата закрывают резиновой пробкой, в которую вставлен конец бюретки 5 для раствора сахара. Реагирующая жидкость в эбулиостате обогревается паровой рубашкой и пропусканием пара через жидкость.

Индикатором при титровании служит метиленовый голубой, который в окислительной среде имеет синий цвет, а в восстановительной бесцветен. Для предотвращения выпадения осадка оксида меди в медно-щелочной раствор добавляют желтую кровяную соль калия, которая образует с Cu₂O растворимое комплексное соединение.

Для проведения анализа приготовляют два раствора: А - 10 г CuSO₄ ·5З₂0 и 0,04 г метиленового голубого растворяют в воде в мерной колбе на 1 дм³ доведением до метки; Б - 50 г сегнетовой соли растворяют в воде, отдельно растворяют в воде 4 г желтой кровяной соли, переносят оба раствора в мерную колбу на 1 дм \ добавляют 75 г NaOH в виде 50% -ного водного раствора и доводят водой до метки.

Прибор для определения PB эбулиостатическим методом и дозаторы растворов. Дозатор для отмеривания раствора А представляет собой два сообщающихся сосуда. Сосуд вместимостью около 100 см³ служит для хранения раствора А и сосуд-пипетка для его отмеривания. На верхнем и нижнем отводах сосуда-пипетки нанесены метки, соответствующие объему 5 cm^j. Для отмеривания раствора А открывают кран / и заполняют сосуд-пипетку до верхней метки. Затем кран закрывают. При отмеривании раствора А и заливании его в эбулиостат открывают кран 2 и спускают раствор до нижней метки. Второй дозатор для отмеривания раствора Б представляет собой пипетку вместимостью 5 см, к верхнему концу которой припаян трехходовой кран. На верхний отвод тройника надета резиновая груша. Раствор Б хранят в колбе вместимостью 100 см', откуда набирают в пипетку, а из пипетки спускают в эбулиостат.

В зависимости от массовой доли PB в растворе и интенсивности его окраски применяют два варианта титрования: для светлых растворов, содержащих 0,13...0,05% PB₁ используют прямое титрование раствором сахара; для темных растворов или растворов, содержащих меньше 0,05% PB₁ применяют дотитровывание раствором глюкозы.

Методика анализа по первому варианту. В колбу прибора наливают воду и ставят прибор на электрическую плитку. Для равномерного образования пара на дно колбы помещают кусочки пористого стекла или шамота. Когда вода закипит, вынимают из колбы эбулиостат и наливают в него из дозаторов сначала 5 см³ раствора А, а затем 5 см³ раствора Б. Осторожно перемешивают растворы в эбулиостате и медленно вставляют эбулиостат вместе с пробкой в колбу.

Затем верхнее отверстие эбулиостата закрывают пробкой с бюреткой, в которую наливают исследуемый раствор сахара. Регулируют выход пара через отводную трубку таким образом, чтобы жидкость в эбулиостате нагрелась до температуры кипения воды примерно за 0,5 мин. Как только пар начнет проходить через медно-щелочной раствор, начинают титрование раствором сахара.

Сначала проводят ориентировочное определение. Раствор сахара из бюретки добавляют по каплям со скоростью одна капля за 1...2 с до перехода окраски раствора из синей в желтую и замечают объем раствора сахара, израсходованного на титрование. Затем проводят окончательное определение. В эбулиостат заливают новую порцию медно-щелочного раствора, подготавливают эбулиостат к титрованию, как указано выше, и начинают титрование. Вначале сразу прибавляют 80...90% объема раствора сахара, израсходованного при ориентировочном определении, и через 2 мин с начала пробулькивания пара через жидкость в эбулиостате дотитровывают, прибавляя раствор сахара со скоростью одна капля за 6...7 с, до перехода синей окраски в желтую от одной капли сахарного раствора.

По бюретке определяют объем раствора сахара, израсходованного на титрование 10 CMⁱ медно-щелочного раствора.

Массовую долю PB₁%, в гидролизате легкогидролизуемых полисахаридов или в разбавленном нейтрализованном гидролизате трудногидролизуемых полисахаридов г, и с_т соответственно рассчитывают по формуле

1

где T₁ - титр медно-щелочного раствора по глюкозе для первого варианта, мг; х - объем гидролизата, израсходованный на титрование 10 см¹ медно-щелочного раствора.

Методика анализа по второму варианту. Подготавливают прибор к работе, как и в первом варианте, но в эбулиостат кроме 5 см¹ раствора А и 5 см³ раствора Б, добавляют, отмеривая пипеткой, определенный объем раствора сахара. В случае темного раствора, содержащего более 0,05% PB, этот объем должен составлять 1...2 см³, а в случае раствора с массовой долей PB менее 0,05% - 5 см³. Затем к жидкости в эбулиостате добавляют из бюретки такой объем раствора глюкозы концентрацией около 0,1 г/100 см³, чтобы на дотитровывание после 2 мин кипячения потребовалось бы не более 1 см³ этого раствора. Добавляемый объем определяют предварительным анализом. Концентрация добавляемого раствора глюкозы должна быть установлена точно; удобнее всего пользоваться раствором глюкозы, приготовленным для установки титра медно-щелочного раствора,

После перемешивания жидкости эбулиостат с пробкой медленно вставляют в колбу, закрывают его пробкой с бюреткой, в которую налит раствор глюкозы. Через 2 мин с начала пробулькивания пара через жидкость в эбулиостате проводят дотитровывание раствором глюкозы, добавляя его со скоростью одна капля за 6...7 с до перехода окраски в желтую от одной капли раствора глюкозы, израсходованного на дотитровывание.

Массовую долю PB,%, в гидролизате легкогидролизуемых полисахаридов или в разбавленном нейтрализованном гидролизате трудногидролизуемых полисахаридов с_л и с_г соответственно рассчитывает по формуле

где T₂ - титр медно-щелочного раствора по глюкозе для второго варианта, мг; с.

При фотоколориметрическом методе для обнаружения бесцветных Сахаров на бумаге хроматограмму проявляют - обрабатывают раствором проявителя, дающего с сахарами окрашенные соединения. Количества разделенных моносахаридов приближенно можно определить непосредственно на хроматограмме прямым измерением интенсивности окраски пятен. Однако из-за нестабильности окраски и существенного влияния условий обработки хроматограмм точность этого метода невелика: относительная ошибка измерений достигает 10...15%. Более точным способом является извлечение окрашенных продуктов из хроматограммы - э л ю и с о в а н и е с последующим фотометрированием полученных растворов - злюатов на фотозлектроколориметре или спектрофотометре.

Для разделения Сахаров применяют специальную хроматографическую бумагу № 1 или Ne 2, которую нарезают полосками. Скорость разделения больше на полоске бумаги с продольным расположением волокон, чем на полоске с поперечным расположением. Иногда для лучшего разделения Сахаров необходимо обеспечить более медленное движение растворителя. С этой целью бумагу нарезают в направлении, перпендикулярном направлению волокон.

Хроматографирование осуществляют нисходящим или восходящим потоками жидкости. В первом случае бумагу подвешивают, укрепляя верхний конец в сосуде с растворителем. Во втором случае бумагу помещают в растворитель нижним концом. Когда сахара трудно разделяются, рекомендуется повторное хроматографирование.

Растворитель должен обеспечивать максимальное различие в значениях R_t и сам должен быть высокоподвижен. При разделении Сахаров используют, например, следующие системы растворителей: этилацетат - пиридин - вода.,; н-бутанол - уксусная кислота - вода; н-бутанол - ацетон - вода, и др. Разделение Сахаров зависит от состава растворителя.

Для повышения эффективности разделения растворителю дают возможность стекать до тех пор, пока сахара не разделятся по всей длине хроматограммы. При этом вычислить значения R₁ невозможно, так как неизвестен путь, пройденный фронтом растворителя. В этом случае подвижность определяют косвенным способом, сравнивая пути, пройденные разделяемыми веществами, с перемещением пятна вещества с известным R_j. В химии углеводов часто используют ксилозу и определяют коэффициент подвижности R_kc как отношение расстояния, пройденного сахаром, к расстоянию, пройденному в этих же условиях ксилозой. Кроме природы сахара и состава растворителя на коэффициент подвижности влияют качество бумаги и температура среды.

В качестве проявителей применяют разнообразные реагенты в зависимости, от состава разделяемых смесей. Для проявления хроматограмм гидролизатов растительных тканей, содержащих редуцирующие сахара, одним из лучших проявителей считают раствор анилинфталата в этаноле. При проявлении анилинфталатом пентозы в зависимости от количества дают окраску от розовой до темно-красной, гексозы - зеленовато-коричневую, рамноза - светло-коричневую. Для элюирования окрашенных соединений из хроматограммы используют ледяную уксусную кислоту или раствор соляной кислоты в этаноле.

Методика анализа. Разделение Сахаров проводят нисходящим способом при непрерывном протекании растворителя по бумаге.

Подготовка гидролизата. Концентрация PB в гидролизате, подготовленном для хроматографирования, должна находиться в пределах 1...3%. При необходимости гидролизат упаривают. Упаривание проводят в вакуум-сушильном шкафу при температуре 50...60°С или при нагревании на водяной бане в фарфоровой чашке или в стеклянном стакане. Гидролизат легкогидролизуемых полисахаридов предварительно нейтрализуют концентрированным раствором гидроксида натрия до слабощелочной реакции и подкисляют концентрированной уксусной кислотой до рН 5, затем упаривают и фильтруют через простую конусообразную воронку с бумажным фильтром. Гидролизат трудногидролизуемых полисахаридов нейтрализуют карбонатом бария и отфильтровывают осадок сульфата бария. Полученный фильтрат сразу подвергают хроматографированию. При необходимости производят упаривание после подкисления уксусной кислотой до рН 5 и снова фильтруют. Кратность упаривания точно определяют и учитывают при расчете масс моносахаридов.

Приготовление растворителя. Для приготовления смеси этилацетат - пиридин - вода 150 см³ этилацетата и 30 см³ пиридина хорошо взбалтывают в делительной воронке вместимостью 500 см³, затем прибавляют к смеси 150 см³ дистиллированной воды и снова хорошо взбалтывают в течение 2...3 мин. После этого смесь оставляют для расслаивания. Когда верхний слой жидкости станет прозрачным, нижний слой сливают, а верхний используют для хроматографирования. Подобным образом готовят и другие составы растворителей, смешивая органические растворители и воду в соответствующих пропорциях.

Хроматографическое разделение. Установка для хроматографирования представляет собой широкий цилиндр с притертой крышкой. Внутрь цилиндра помещают малый цилиндр, на который ставят чашку с растворителем.

Нарезают 10...12 полосок хроматографической бумаги размером 3ч45 см. При хроматографировании нижний конец полоски может свободно свисать либо его вырезают в виде "язычка", который вставляют в горлышко колбочки-приемника. На расстоянии 10...15 см от другого конца полоски отмечают точку старта, на которую наносят определенное количество подготовленного гидролизата. Все отметки, на бумажной полоске делают только графитовым карандашом.

Пробу гидролизата наносят микропипеткой со специальным приспособлением, состоящим из резиновой груши в металлическом кожухе и микровинта с шариком. Если упаривание гидролизата нежелательно, то на бумагу наносят несколько раз в одно и то же место необходимый объем раствора сахара, который рассчитывают исходя из массовой доли PB. После нанесения каждой порции раствора пятно хорошо просушивают. Диаметр нанесенного пятна не должен превышать 5...6 мм.

Полоски устанавливают в строго вертикальном положении. Конец полоски, на который нанесена проба, загибают в чашку. Пятно пробы должно находиться снаружи чашки ниже ее края не менее чем на 2 см. Второй конец вставляют в колбочку-приемник. Для лучшей идентификации Сахаров в установку помещают также полоску бумаги с нанесенным раствором смеси чистых моносахаридов: галактозы, глюкозы, маннозы, арабинозы, ксилозы. В чашку наливают растворитель и установку герметично закрывают крышкой.

Хроматографирование проводят при температуре 18...22°С, помещая установку в специальную комнату или шкаф. Разделение осуществляется за 24...90 ч. Хроматографирование считают законченным тогда, когда на проявленной хроматограмме расстояния между пятнами будут не менее 3 мм.

После окончания разделения Сахаров хроматограммы сушат на воздухе в течение примерно 4 ч до полного удаления растворителя. При сушке хроматограммы перекидывают через стеклянную палочку, укрепленную на двух штативах.

Проявление хроматограмм. Проявителем служит раствор, содержащий 1,66 г фталевой кислоты и 0,92 см³ свежеперегнанного анилина в 100 см³ этанола.

Сухие хроматограммы смачивают равномерно проявителем кратковременным погружением в раствор, отжимают между листами фильтровальной бумаги и немного подсушивают на воздухе. Затем хроматограммы помещают в сушильный шкаф, предварительно нагретый до нужной температуры. _m Несколько хроматограмм одновременно кладут на ребро так, чтобы они не касались друг друга и стенок шкафа. Проявление ведут при температуре 100...105°С в течение 5 мин. Аналогичным образом проявляют полоски бумаги с нанесенным раствором смеси чистых Сахаров. При установлении природы Сахаров руководствуются цветом пятен, их относительным расположением и расположением пятен чистых Сахаров.

Фотоколориметрическое определение Сахаров. Из проявленной хроматограммы вырезают участки, соответствующие отдельным сахарам, и разрезают их на узкие полоски. Помещают кусочки хроматограмм в пробирки с пришлифованными пробками и заливают 8 см³ раствора HCI в этаноле. Элюирование ведут в течение 1 ч при комнатной температуре, поместив пробирки в темноту. Через каждые 5...10 мин пробирки энергично встряхивают.

Элюаты сливают в подготовленные сухие пробирки и фото-метрируют - измеряют оптическую плотность на фотоэлектрическом колориметре при синем светофильтре в кювете толщиной 10 мм или же на спектрофотометре при длине волны 420 нм.

Массу каждого моносахарида определяют по соответствующим градуировочным графикам.

Зная массу сахара в пробе гидролизата, нанесенной на хроматограмме, объем этой пробы, кратность упаривания и общий объем гидролизата, рассчитывают массовую долю, % к абсолютно сухой древесине, соответствующих полисахаридов Р - глюканов, маннанов, галактанов, ксиланов, арабинанов

где Ь - масса моносахарида в пробе гидролизата, мкг; х - объем пробы гидролизата, взятый на хроматографирование, см³; V - общий объем гидролизата, V=500 - или 200 см³; k - коэффициент пересчета моносахаридов на полисахариды, £ = 0,90 для гексозанов и 0,88 для пентозанов; з - кратность упаривания; g - масса абсолютно сухой навески древесины, г.

Построение градуировочных графиков. Градуировочный график для каждого моносахарида представляет собой зависимость оптической плотности элюата от массы сахара на хроматограмме. Для построения графиков готовят точно 1% -ные растворы чистых моносахаридов. На полоску хроматографической бумаги на расстоянии 3...4 см друг от друга наносят разные количества 1% -ного раствора сахара: 0,01; 0,02; 0,03; 0,04 и 0,05 см³. После высыхания пятен полоску проявляют раствором анилинфталата в этаноле в точно таких же условиях, как и при анализе гидролизатов. Проводят элюирование и фотометрирование, как описано выше. На основании средних данных нескольких параллельных определений для каждого моносахарида строят градуировочный график. Иногда градуировочный график для глюкозы используют для всех гексоз, а график для ксилозы - для всех пентоз. Последний способ менее точен.