Основной мишенью его являются макрофаги, а также подобные им клетки, имеющие к нему высоко аффинные рецепторы. Общая В-субъ- единица токсина, являющаяся протективным антигеном, обеспечивает ферментативным субъединицам единый механизм проникно­вения в цитозоль клетки, что необходимо для синергидного действия последних. Вначале протективный антиген связывается с высоко аффинными рецепторами эукариотических клеток. Затем под действием фурина — про-теазы клетки-мишени из него образуется ак­тивная форма, имеющая молекулярную массу 63 кД (ПА 63), которая, образуя гептамеры, связывающие летальный фактор (А 1) и отечный фактор (А2), участвует в формировании рН ионопроводящих (катионселективных) кана­лов и транслокации А1 и А2 в цитозоль клетки путем рецепторного эндоцитоза. Летальный фактор — металлопротеаза, мишенью кото­рой служит митогенанактивируемая киназа протеинкиназ. Он оказывает свое действие в течение нескольких минут, перемещаясь из прелизосомного пространства в лизсому через кислотное внутриклеточное окружение. Действие летального фактора проявляется в продуцировании активных форм кислорода в макрофагах и нейтрофилах, что сопровож­дается увеличением перекисных соединений в макрофагах и деструкции последних (цито-токсическое действие). Отечный фактор био­химически является зависимой от кальция и кальмодулина аденилатциклазой, образуемой микоробами в неактивной форме. Она ак­тивируется при внутликлеточном контакте а белком эукариотов — кальмодулином, от­сутствующим у бактерий. Ее мишенью явля­ется АТФ. Аденила гциклаза индуцирует синтез вторичных мессенджеров. Повышение уровня цАМФ в клетках сопровождается угнетением фагоцитарной функции клеток, нарушением слияния фагосомы с лизосомой, обезвожива-

нием клеток и экскреции источников энер­гии в результате нарушения проницаемости клеток. Очевидно, цАМФ используется бак­териями для подавления многих нормальных функций фагоцитов, что позволяет микробам дольше выживать во внутренней среде мак­роорганизма. При этом развитие сибиреяз­венной инфекции предполагает обязательное совместное участие всех трех компонентов сибиреязвенного токсина.

Активаторы иммунного ответа. К данной группе токсинов относятся: токсин синдро­ма токсического шока (TSST-1), энтероток-сины и эксфолиативные токсины S . aureus , пирогенные экзотоксины S . pyogenes и ряд токсинов других микробов. Они относятся к суперантигенам (PTSAg) и могут действовать непосредственно на антигенпрезентуюшие клетки иммунной системы (АРС) и Т-лим-фоциты. Их иммуностимулирующий эффект является результатом способности связывать различные участки экспрессированных на поверхности АРС МНС 2 класса снаружи от пептидсвязывающего участка и специфичес­ких VP-элементов на Т-клеточном рецепторе. Например, beta-домен стафилококкового TSST-1 связывает аlfa-цепь МНС 2 класса на макрофа­гах, в то время как А-домен специфически связывается с Vbeta2-элементами рецепторов Т-клеток, что ведет к массивной пролифера­ции Т-клеток, сопровождающейся образова­нием большого количества лимфоцитарных (интерлейкин-2, у-интерферон), а также мо-ноцитарных цитокинов (интерлейкин-1, ин-терлейкин-6, а-фактор некроза опухолей). Совместно эти цитокины вызывают развитие гипотензии, высокую температуру и диффуз­ную эритематозную сыпь. Стафилококковый эксфолиативный токсин (син. эксфолиатин, эпидермолитический токсин) разрушает меж­клеточные контакты (десмосомы) зернисто­го слоя эпидермиса, что ведет к отслоению (десквамации, эксфолиации) поверхностных слоев эпидермиса и образованию лопаю­щихся пузырей, наполненных серозным или гнойным содержимым.

Бактериальные токсины сходны по струк­туре и целому ряду других свойств с сигналь­ными молекулами макроорганизма: гормона­ми, нейромедиаторами, интерферонами и т. д.

В ходе лиганд-рецепторного взаимодействия с клетками макроорганизма они используют уже готовые структуры, участвующие в нейро-эндокринной сигнализации. Формирование пор тоже не является их уникальным свойс­твом. Можно предположить, что, являясь ан­тиметаболитами сигнальных молекул макро­организма, они первоначально имитируют их действие, а в последующем оказывают блоки­рующий эффект.

Универсальность белковых токсинов заклю­чается в их полифункциональности, не огра­ничивающейся их значением только лишь как факторов патогенности. Образование бел­ковых токсинов играет существенную роль в экологии бактерий, их существованию в природных биоценозах, где они играют роль сигнальных молекул и оказывают токсичес­кое воздействие на эукариотические клет­ки грибов и простейших. Благодаря сходству строения с бактериоцинами, они оказывают токсическое воздействие и на конкурентов, в том числе представителей нормальной мик­рофлоры макроорганизма. Обладая фермен­тативной активностью, они выполняют тро­фическую функцию жизнеобеспечения самой микробной клетки.

В отличие от эндотоксинов, белковые ток­сины, помимо химической структуры и специ­ фичности действия, обладают высокой токсич­ ностью. Они вызывают гибель лабораторных животных при введении им всего нескольких микрограммов токсина, тогда как эндотокси­ны вызывают гибель животных при введении доз, равных сотням микрограмм. Как и виру­лентность, сила действия белковых токсинов измеряется величиной летальных доз (LD) — Del, Dlm и LD50. Это полноценные тимуеза- висимые антигены, к ним образуются антите­ ла, нейтрализующие их — антитоксины. При этом фрагменты А и В в антигенном отноше­нии не идентичны. Протективным действием обладают антитела к С-терминальной части фрагмента В, блокирующие прикрепление токсина к специфическому рецептору клет­ки. Из белковых токсинов можно получить анатоксины, т. е. токсины, лишенные своих токсических свойств, но сохранивших антиген­ные свойства, что используют при проведении вакцинопрофилактики. Одним из методов

получения анатоксинов является формоловая детоксикация по G. Ramon (1923), приводя­щая к химической модификации активного центра токсина и обуславливающая жесткость структуры белковой молекулы, препятству­ющей ее диссоциации. Заболевания, при ко­торых микроорганизм остается в месте вход­ных ворот инфекции, а в основе патогенеза заболевания и его клинических проявлений лежит действие белкового токсина, называ­ются токсинемическими инфекциями (анаэроб­ная раневая инфекция, столбняк, ботулизм, дифтерия). Такое разделение заболеваний имеет важное значение как в плане проведе­ния микробиологической диагностики, так и лечения, поскольку наиболее эффективны­ми препаратами для специфического лече­ния токсинемических инфекций являются не антибиотики, а своевременно применяемые антитоксические сыворотки, в ряде случаев сочетаемые с введением анатоксинов (пас­сивно-активная терапия). Использование ан­тибиотиков, которые действуют на бактерии, а не на их токсины, уходит на второй план. В качестве же средств специфической про­филактики токсинемических инфекций для создания искусственного активного приобре­тенного иммунитета необходимо применять анатоксины, а для создания искусственного пассивного приобретенного иммунитета в це­лях экстренной профилактики токсинеми­ческих инфекций необходимо применять ан­титоксические сыворотки {активно-пассивная профилактика).

Большинство белковых токсинов разруша­ется пищеварительными ферментами и оказы­вает свое воздействие только при парентераль­ном введении. Исключение составляют токси­ны С. botulinum , энтеротоксины С. perfringens , С. difficile , S . aureus и энтеротоксины грамот -рицательных бактерий, проявляющих свое действие при пероральном поступлении в макроорганизм.

Синтез белковых токсинов кодируется гена­ ми, локализованными в хромосоме и сцеплен­ными с генами, участвующими в спорообра­зовании или входящими в состав профага, а также генами, локализованными в плазмидах. Это tox+ гены, ответственные за токсиген-ность. Активность tox+ генов контролирует-

ся белками-репрессорами микробной клет­ки. Первоначальной функцией этих генов у сапрофитов был синтез структурных белков фага, компонентов оболочек спор или син­тез ферментов, необходимых для усвоения аминокислот. По мере закрепления парази­тического образа жизни эти специализиро­ванные адаптивные ферменты превратились в яды — белковые токсины.

Способность микроорганизмов образовы­вать белковые токсины необходимо учиты­вать также при проведении микробиологи­ческой диагностики. При этом необходимо помнить, что все патогенные штаммы данно­го вида могут продуцировать только один тип токсина по антигенной структуре и механиз­му действия(С. diphtheriae , С. tetani ), разные по антигенной структуре, но одинаковые по механизму действия токсины (С. botulinum ). С другой стороны, один и тот же вид микроба может образовывать разные типы белковых токсинов, а также эндотоксины, например диареегенные Е. coli, шигеллы и сальмонел­лы, возбудитель холеры.

Эндотоксины и их биологические свойства. Свойство бактерий образовывать токсические вещества, вызывающие симптомы интоксика­ции, в том числе выделять в окружающую среду при их разрушении эндотоксины, называется токсичностью. Эндотоксины относятся к бакте­риальным модулинам, обладающим огромным спектром биологической активности, индуци­рующим синтез цитокинов и других медиаторов. В отличие от белковых токсинов, эндотоксины термостабильны и образуются грамотрицатель- ными бактериями, выделяясь в окружающую среду только после гибели бактериальной клет­ки. Это сложные белковолипополисахаридные комплексы, которые в лабораторных услови­ях можно получить путем экстракции трихло-руксусной кислотой по Буавену (A. Boivin) и Месробяну (L. Mesrobeanu). Полный антиген, антиген Буавена содержит до 10 % белка. Он входит в состав клеточной стенки грамотри-цательных бактерий. Данные комплексы со­стоят из белка — пептида, обуславливающего иммуногенность комплекса; фосфолипида В, включающего в свой состав фосфатидилхо-лин — основной компонент клеточной стенки бактерий; двухвалентных ионов Са и Mg; ЛПС,

входящего в состав наружной мембраны кле­точной стенки грамотрицательных бактерий, который и является собственно эндотоксином, его основным компонентом (липополисахарид-ная фракция полного антигена, без белкового компонента). В наиболее чистом виде ЛПС получают путем водно-фенольной экстракции по Вестфалю (О. Westphal). Карболовая кислота разрушает белки. ЛПС состоит из липида А и собственно полисахарида, в состав которого входит базисная часть — R-ядро, образованное 3-дезокси-D-манно-октулозоновой кислотой и остатками гептоз, а также О-специфичес-ких олигосахаридных цепей, обуславливающих антигенную специфичность ЛПС грамотрица­тельных бактерий. Липид А и R-ядро поли­сахарида имеют одинаковое строение у всех грамотрицательных бактерий, за исключением

B. pertussis, В . abortus, В . fragilis, P. aeruginosa,

C. violaceum , R . viridis , R . tenue , у которых они об­
ладают ярко выраженной индивидуальностью.
Синтез отдельных компонентов ЛПС происходит
в бактериальной клетке независимо и контроли­
руется генами, локализованными в хромосоме.
Вирулентные бактерии синтезируют полную
структуру ЛПС и образуют S-форму микроба, у
которой О-специфические цепи составляют ²/₃
ЛПС. Бактерии со сниженной вирулентностью
не имеют О- специфических цепей и образуют
R-формы микроба. Они имеют многочислен­
ные бреши во внешней мембране, что сопро­
вождается нарушением ее проницаемости.

За проявления биологической активнос­ти эндотоксинов ответственна вся молеку­ла ЛПС, а не отдельные его компоненты. В отличие от белковых токсинов, они не об­ладают органотропностью и специфичностью действия. Симптомы интоксикации при за­болеваниях, вызванных грамотрицательными бактериями, однотипны, и связаны с дейс­твием образующихся медиаторов воспаления. В основе действия ЛПС лежит его неспеци­фическое липид-липидное и специфическое, за счет рецепторов CD14, взаимодействие с мембранными компонентами разных типов клеток: тромбоцитов, гранулоцитов, эритро­цитов, лимфоцитов, моноцитов и макрофагов, которые под действием ЛПС выделяют био­логически активные вещества. ЛПС запускает в макроорганизме синтез более 20 различ-

ных биологически активных веществ, кото­рые обуславливают патогенез эндотоксикоза и обладают пирогенным действием. Основной точкой его приложения являются макрофаги. Образование больших доз эндотоксина со­провождается угнетением фагоцитоза, явле­ниями выраженного токсикоза, слабостью, одышкой, диареей, нарушением сердечно­сосудистой системы, снижением давления, гипогликемией, лейкопенией, сменяющейся лейкоцитозом, агрегацией тромбоцитов, ги­потермией. При образовании больших коли­честв эндотоксина в крови вследствие усилен­ного разрушения большого количества гра-мотрицательных бактерий возможно развитие эндотоксинового шока. При образовании не­больших доз эндотоксина отмечается сла­бый токсикоз и повышение температуры тела, стимуляция фагоцитоза. ЛПС относится к ти- муснезависимым антигенам и вызывает поли- клональную стимуляцию В-лимфоцитов, акти­вирует систему комплемента по альтернатив­ному пути, является адъювантом. Небольшие дозы эндотоксина, образующиеся постоянно представителями нормальной микрофлоры тела человека в кишечнике, оказывают бла­гоприятное стимулирующее воздействие на клетки иммунной системы макроорганизма, что ведет к повышению неспецифической резистентности макроорганизма, усилению его устойчивости к инфекционным заболе­ваниям, повышению радиорезистентности и увеличению противоопухолевой активности клеток. В результате поликлональной стиму­ляции и активации системы комплемента по альтернативному пути макроорганизм нахо­дится в постоянной готовности к встрече с самыми разнообразными микробами и может противостоять им до образования специфи­ческих факторов защиты. С другой стороны, длительное присутствие поликлонального стимулятора в макроорганизме может вести к включению запретных клонов клеток и раз­витию аутоиммунных реакций. В ходе иммун­ного ответа первоначально на введение ЛПС образуются О-антитела, которые не обладают антитоксической активностью. Симптомы интоксикации уменьшаются после образова­ния антител к R-ядру полисахарида и липиду А. Так как они имеют одинаковое строение у

грамотрицательных бактерий, то антитела к ним пытаются применять для лечения септи­ческих процессов, вызванных данными мик­робами. В отличие от белковых токсинов, из эндотоксинов нельзя получить анатоксины.

Изучение антигенной специфичности ЛПС используется при проведении идентифика­ции грамотрицательных бактерий.

Кроме токсинов, в ходе инфекционного процесса в результате размножения микробы образуют целый ряд других токсических про­дуктов метаболизма, такие как ядовитые ами­ны, холин, нейрин, высшие жирные кислоты и т. д. Одновременно с их действием проис­ходит отравление организма токсическими продуктами распада собственных клеток и тканей, что играет важную роль в развитии интоксикации.

Таким образом, патогенность носит сложный полидетерминантный характер. Основными материальными носителями патогенности микробов являются морфологические струк­ туры клетки, ферменты и токсины. В макро­организме они оказывают не изолированное, а комплексное воздействие. Например, ней-раминидаза холерного вибриона способствует адгезии возбудителя к эпителиальным клеткам слизистой оболочки тонкого кишечника и вза­имодействию его энтеротоксина с ганглиозид-ными рецепторами клеток, а гемо-цитолизин, образуя каналы в мембране клеток, ведет к их осмотическому повреждению и делает адени-латциклазу клеточных мембран более доступ­ной. Показана относительность деления фак­торов патогенности по их функциям. Один и тот же фактор патогенности может участвовать в различных фазах инфекционного процес­са, а в одной и той же фазе могут участвовать различные факторы патогенности. Например, капсулы бактерий способствуют их адгезии, препятствуют фагоцитозу и экранируют ком­поненты клетки, активирующие комплемент по альтернативному пути. Эндотоксины и ин-вазивные белки грамотрицательных кишечных бактерий не только способствуют их инвазии и развитию симптомов интоксикации, но и за­щищают бактерии от действия соляной кисло­ты и ферментов в желудке. В основе действия всех факторов патогенности лежат одни и те же принципиальные закономерности, связанные

со способностью активных биомолекул возбу­дителя (лигандов) к распознаванию на клет­ках-мишенях комплементарных структур, свя­зывание с которыми ведет к инициации разви­тия инфекционного процесса, патологические проявления которого связаны с синтезом тех или иных ферментов и токсинов. Факторы па­тогенности используются микробами не толь­ко в макроорганизме, но и при их попадании в окружающую среду с целью колонизации ее объектов и сохранения жизнеспособности в борьбе с конкурентами.

8.3.3. Генетическая регуляция факторов патогенности

Патогенность бактерий носит полиде-терминантный характер и контролируется группой генов. Большинство генетических детерминант факторов патогенности рас­полагается на хромосомах отдельными клас­ терами из функционально связанных групп генов. Эти последовательности отличаются от большей части генома, что позволило вы­двинуть предположение об их чужеродном происхождении. Подобные им структуры были также найдены на плазмидах.

При этом наблюдается своеобразное раз­деление функций между хромосомой и плаз-мидами. Например, у шигелл и энтероинва-зивных кишечных палочек плазмидные гены обуславливают взаимодействие возбудителей с эпителием, а хромосомные — существование и размножение бактерий в просвете кишки и тканях. Эти данные позволили выдвинуть концепцию о ведущей роли «островов» ( islands ) или «островков» ( islets ) патогенности и системе секреции факторов патогенности 3-го типа.

Под «островками» патогенности принято понимать как не стабильные, так и стабиль­ные участки ДНК, обнаруженные только у патогенных бактерий, включающие дис­кретные (разобщенные, состоящие из от­дельных групп) гены вирулентности. Они отсутствуют у непатогенных близкородс­твенных видов.

Эти фрагменты ДНК отличаются по про­центному содержанию G+C от основного генома, фланкированы малыми прямыми повторами нуклеотидных последовательнос­тей. Такие «островки» патогенности нередко несут криптические или функционирующие гены фаговых интеграз, транспозаз и дру­гих фрагментов транспозонов или IS-элемен-тов, относимых к мобильным генетическим элементам. Структурная организация «ост­ровков» может быть различной, так как ге­ны вирулентности часто включены в состав транспозонов, IS-элементов или генома бак­териофагов. Детерминанты «островков» пато­генности способны распространяться среди одного или родственных видов бактерий пу­тем конъюгации, трансдукции и трансфор­мации. Интеграция, стабилизация и экспрес­сия этих генов лежат в основе формирования новых свойств, в том числе вирулентных, у родственных непатогенных видов. Известны «островки» патогенности, несущие гены ад-гезинов, инвазинов, различного типа токсинов, генов лекарственной устойчивости, белков сис­темы секреции и т. д.

Прежде чем достичь своей потенциальной мишени, факторы патогенности преодолева­ют два основных барьера — цитоплазмати-ческую мембрану и клеточную стенку микро­бов-продуцентов. При этом большая часть их после секреции становится функционально активной. Поэтому большое значение прида­ют системе секреции третьего типа.

Система секреции 3-го типа ответственна за одноэтапный транспорт эффекторных молекул патогенности из цитоплазмы бак­терий в цитозоль эукариотической клет­ки макроорганизма, где они осуществляют модификацию цитоплазматических белков поражаемых клеток макроорганизма.

Данная система также обеспечивает сбор­ку на поверхности бактериальной клетки супермолекулярных структур, участвующих в транспорте протеинов в эукариотическую клетку макроорганизма. Секреция эффектор­ных белков данной системой происходит не­посредственно после контакта возбудителя с

клеткой хозяина, поэтому ее называют кон­такт-зависимой системой секреции.

«Островки» патогенности могут вклю­чать несколько различающихся фрагментов. Экспрессия генов вирулентности носит ин-дуцибельный характер и зависит от условий внешней среды, вне- или внутриклеточно­го расположения возбудителя. Описано не­сколько систем регуляции фенотипического проявления факторов патогенности у бак­терий. Гены, детерминирующие их синтез, обычно репрессированы. Включение или выключение их происходит под действием сигналов, поступающих из внешней среды. Такими сигналами являются изменившийся биохимический состав среды, ее рН, темпера­тура, осмотическое давление и т. д. Микробы адаптируются к новым условиям и в зависи­мости от своего внутри или внеклеточного расположения изменяют свой метаболизм. Обычно они используют один или несколько из этих сигналов для того, чтобы понять, в какой микросреде и на какой стадии разви­тия инфекционного процесса они находятся. Например, гены инвазии обычно включаются на ранней стадии инфекционного процесса, но подавляются, когда бактерии проника­ют в клетку. Процесс адаптации микроба к новым, меняющимся условиям контролиру­ется двухкомпонентными регуляторными сис­ темами. Эти системы состоят из двух типов белков: сенсорного белка клеточной мембраны, воспринимающего и передающего сигналы из внешней среды внутрь клетки, и регуля-торного цитоплазматического белка, который непосредственно регулирует транскрипцию генов хромосомы и плазмиды, являясь ак­тиватором или репрессором транскрипции. Внутриклеточный домен сенсорного белка представлен гистидинкиназой. В качестве соответствующего сигнала может выступать аутофосфорилирование сенсора. Перенос фосфат-остатка на аминогруппу белка-регу­лятора изменяет способность последнего свя­зывать специфические последовательности ДНК, с которых инициируется транскрипция. Эти последовательности содержат консерва­тивные начальные участки для связывания с белком-регулятором. Включение и активация группы вирулентных генов (регулона) на об-

щий сигнал происходит в несколько стадии и носит каскадный принцип. В ряде случаев каждый из этих генов может экспрессиро-ваться независимо.

Помимо двухкомпонентных регуляторных систем существуют также системы регуляторов транскрипции. Наиболее полно изучено Аго А-семейство регуляторов транскрипции, по­лучивших свое название благодаря продукту ага С гена Е. coli , контролирующего функцию арабинозного оперона. Белки этой группы со­держат изгибы, которые связываются с нача­лом специфических ДНК-фрагментов генов, что активирует транскрипцию последних.

К регуляторному механизму относят также топологию ДНК, рассматриваемую в качес­тве глобальной регуляторной системы, ис­пользуемой и для экспрессии вирулентности. Реализуется указанное через топоизомеразы и гистоноподобные ДНК-связывающие белки, регулирующие уровень суперскрученности молекулы и реагирующие на определенные сигналы извне. Эти же сигналы влияют на транскрипцию соответствующих генов.

Все эти механизмы регуляции взаимосвяза­ны между собой. Значимость каждого из них постоянно меняется.

Нестабильность «островков» патогеннос­ти, как и их стабильность, способна создать бактериям определенные адаптивные пре­имущества. Высокая вирулентность может оказаться невыгодной для бактерий на опре­деленной стадии инфекционного процесса. Нестабильность «островков» патогенности будет способствовать снижению вирулент­ности всей популяции возбудителя инфек­ции. Их делеция может усилить экспрессию других, рядом расположенных генов.

В то же время отдельные факторы патоген­ности являются адаптивными для бактерий, поэтому должны кодироваться - на стабиль­ных «островках» патогенности. Чужеродность последних придает им большую стабильность, так как чужеродная ДНК, интегрированная в хромосому, не вовлекается в рекомбинацию с ДНК близкородственных микроорганизмов, поэтому они могут длительно поддерживаться в бактериальных популяциях.

Циклические фенотипические или моди-фикационные изменения вирулентности про-

исходят при смене организменной и внеорга-низменной стадии существования микробов. В иммунном организме и вне организма со­храняются маловирулентные резервационные штаммы. Попадая в макроорганизм, из них формируются высоковирулентные эпиде­мические штаммы. По мере формирования иммунитета из последних снова происходит формирование резервационных штаммов. Стойкие изменения вирулентности возника­ют в случае мутаций и рекомбинаций и связа­ны с изменениями генотипа микроба.

Реорганизация генов, кодирующих факто­ры патогенности, в ходе инфекционного про-лесса происходит на молекулярном уровне, но на популяционном уровне создаются условия хтя естественного отбора эпидемических, или резервационных, штаммов. Благодаря при­нципу распознавания кворума бактерии обла­дают способностью «разговаривать». Кворум генсинг — это химический сигнальный механизм бактерий, благодаря которому, попав в новую среду обитания, они считают себе подобных. Чем больше в округе бактерий, тем боль­ше химических сигналов они выделяют. Чем больше концентрация химического сигнала, тем больше воспринимающих его рецепторов у бактерии работает. В том случае если бакте­рий много (кворум), они начинают синтези­ровать факторы патогенности и принимают воинственную вирулентную форму, которая может справиться с иммунной системой мак­роорганизма. Если же сил не хватает, то армия бактерий будет отсиживаться в засаде и ждать благоприятного момента. Знание механизмов кворум-сесинга позволяет по-новому подой­ти к лечению инфекционных заболеваний, в том числе вызванных антибиотико-резистен-тными штаммами бактерий.