Способ Виньяля-вейона. Берут 4-5 пробирок с 0,5% расплавленным и охлажденным до температуры 40-45⁰С сахарным агаром. В содержимое одной из них вносят пипеткой небольшое количество исследуемого материала и тщательно размешивают. Для уменьшения концентрации материала с целью получения изолированных колоний засеянную среду в количестве, соответствующем объему внесенного материала, переносят из 1-й пробирки во 2-ю, из 2-й в 3-ю. Затем содержимым каждой пробирки заполняют капилляры трех пастеровских пипеток.

Чтобы предупредить застывание питательной среды в момент насасывания ее в пипетки, кончик их, пока он не обломан, погружают на 3-5 минут в стерильную воду при температуре 45-50⁰С. После заполнения вытянутый конец трубки запаивают и помещают в стеклянный цилиндр с ватой на дне. Через 2-3 суток в столбике агара вырастают ясно видимые колонии микробов-анаэробов. Выросшие колонии легко изолировать. Для этого капилляр надрезают напильником выше уровня намеченной колонии, надламывают, а колонию микрорганизма, находящуюся в агаре, извлекают петлей и пересевают в свежую питательную среду.

Выращивание анаэробов в условиях вакуума. Вакуумные условия для выращивания анаэробов создают в анаэростате или эксикаторе. Исследуемый материал или культуру микроорганизмов засевают в пробирки с жидкой средой или на чашки Петри с плотной питательной средой. Сразу после посева чашки со средами помещаются в микроанаэростат с палладиевым катализатором (Oxoid) для поглощения кислорода и индикатором для выявления свободного кислорода (Disposable anaerobic indicator BBL, Becton Dickinson). Катализатор перед употреблением регенерируют в сухожаровом шкафу при температуре +175-180⁰С в течение часа. Затем микроанаэростат закрывают, удаляют из него воздух при помощи вакуумного насоса, после чего микроанаэростат заполняют нулевым поверочным азотом. Вновь удаляют газ из микроанаэростата, заполняют его газовой смесью (10% СО₂, 10% Н₂, 80% N₂) и помещают в термостат. Анаэробные условия в микроанаэростате могут быть созданы и при использовании коммерческих газогенерирующих пакетов для анаэробов (BioMerioux; Becton Dickinson). После 48 часов инкубации проводят первый учет чашек с отсевом типичных колоний на жидкие питательные среды для анаэробов (Rosenow cysteine, Diagnostics Pasteur; Schadler with Vitamin K1, BBL, Becton Dickinson; Thioglycolate, Serva) для изучения культуральных свойств микроорганизмов и последующей идентификации, а также отсевов на плотные питательные среды, которые затем культивируют в аэробных условиях, чтобы убедиться, что выросшие микроорганизмы не являются факультативно-анаэробными. После первого учета чашки возвращают в микроанаэростат и инкубируют еще в течение 72 часов. Затем повторно изучают морфологию колоний, обращая особое внимание на появление черного пигмента, и производят отсев в жидкие питательные среды материал из тех колоний, которые отсутствовали при первом учете чашек, т. е. через 48 часов инкубации.

Микроаэрофилы (G.vaginaluis и Lactobacillus sp.) выращиваются в условиях пониженного содержания О₂ в атмосфере СО₂ в эксикаторе.

Анаэростат – прибор для выращивания микроорганизмов в анаэробных условиях – представляет собой толстостенный металлический цилиндр с герметически привинчивающейся крышкой, на которой имеются вакууметр и два крана для присоединения к вакуум-насосу.

Коммерческие микроанаэростаты (BbioMerioux, Becton Dickinson, Oxoid) представляют собой пластиковые цилиндры различного объема с металлическими плотно закрывающимися крышками, на которых также имеются вакууметр и два крана.

Химические методы выращивания анаэробов
(Метод Аристовского)
Материал, исследуемый на наличие анаэробов, засевают на среду в чашки Петри и помещают их в эксикатор, на дно которого кладут химический поглотитель кислорода: гидросульфат натрия или пирогаллол. В расширенную часть сосуда устанавливают на подставке чашки с посевами. Прибор помещают в термостат при температуре 37⁰С на 24-48 часов.

Биологический метод выращивания анаэробов
(по Фортнеру)
В чашку Петри наливают толстым слоем 5% кровяной агар с 1-2% глюкозы. Посередине чашки в питательной среде вырезают стерильным скальпелем канавку шириной 1-1,5 см, которая делит питательную среду на две половины. Одну из них засевают культурой анаэробов или исследуемым на их наличие биологическим материалом, другую половину – культурой аэробов: Serratia marcescens или E.coli. Перед посевом чашки подсушивают в термостате, чтобы анаэробы вместе с капельками влаги не могли попасть на другую сторону чашки. Засеянные чашки закрывают, а свободное пространство между дном и крышкой заклеивают лейкопластырем, чтобы предупредить поступление в чашку кислорода извне. В термостате чашки устанавливают вверх дном. Быстрорастущие аэробы, поглощая находящийся в чашке кислород, создают тем самым благоприятные условия для роста анаэробов.

Большинство грамотрицательных анаэробных бактерий могут быть изолированы на средах с добавлением канамицина (100 мг/л), ванкомицина (7,5 мг/л), гемина (10 мг/л), витамина К₃ (менадион, 1,5 мг/л) или К₁(фитоменадион, 1,5 мг/л), а также бараньих эритроцитов (5%). К базовым относятся среды Columbia agar Base (BBL, Becton Dickinson; BioMerioux), Schaedler agar или Wilkins Chalgren agar (Oxoid). При количественном методе исследования материал засевают из 10^-6, 10^-7 и 10^-8 разведений. Срок инкубирования составляет 48 часов при температуре 35⁰С.

Для выделения бифидобактерий используют среду Блаурокка. Для предотвращения роста аэробных бактерий в среду добавляют азид натрия в концентрации 100 мг/л. При количественном методе исследования посев производят из 10^-5, 10^-7 и 10^-9 разведений. При полуколичественном методе исследования посев проводят методом агаровых столбиков в полужидкой питательной среде, либо на плотной питательной среде на чашке Петри. Инкубацию проводят в микроанаэростате при +37⁰С в течении 48 часов. В том случае, если посев производился в толщу среды, после инкубации отмечают образование зоны задержки роста и газообразование. В агаре бифидобактерии образуют характерные колонии, напоминающие гречишные зерна, но могут также образовывать колонии в форме дисков.

Грамположительные анаэробные кокки выделяют на базовых средах (Columbia agar Base и др. см. выше), с добавлением бараньей крови (5%), налидиксовой кислоты (10 мг/л) и колистина (10 мг/л) или фенилэтилалкола (2,5 г/л).

Выделение бактерий рода Mobiluncus проводят с использованием Columbia agar Base с добавлением 2,5% лошадиной сыворотки, 15 мкг/мл налидиксовой кислоты и 1,0 мкг/мл тинидазола. Возможно использование и другой селективной среды – Columbia agar Base с добавлением 5% бараньей крови, 10 мкг/мл колистина и 15 мкг/мл налидиксовой кислоты. Инкубация посевов производится в анаэробных условиях 4-5 дней при температуре +37⁰С.

Для выделения клостридий используют плотную среду RCM (Oxoid). В прбирки с расплавленной средой, разлитой по 9 мл и охлажденной до +48⁰С, засевают взятый материал (при количественном методе исследования посев производят из 10^-3, 10^-5 и 10^-7 разведений). Быстро ресуспендируют, затем в каждую пробирку добавляют небольшое количество (1,5 см) расплавленной среды RCM, содержащей метиленовую синьку в концентрации 1:20000 для того, чтобы предохранить среду от диффузии кислорода. Учет результатов производится через 16-18 часов инкубации. Для выделения C.perfringens используют селективную питательную среду TSC (Oxoid). В среду добавляют Д-циклодекстрин (400 мг/л) и эмульсию яичного желтка (50 мг/л) (Oxoid). С.perfringens на этой среде приобретают черный цвет, из за содержания в ней метабисульфита натрия и цитрата железа. Наличие эмульсии яичного желтка позволяет различить лецитиназопозитивные клостридии.

Культуральные признаки микрооганизмов определяются характером их роста на питательных средах. Будучи постоянными для каждого вида микроорганизма, они являются важным диагностическим признаком.

Идентификация выделенных чистых культур бактерий в зависимости от целей может быть ориентировочной (определение рода) или финальной (определение вида).

Видовая идентификация выделенных чистых культур бактерий проводится общепринятыми методами с использованием номенклатуры Берджи и сведений, обобщенных в руководствах по клинической микробиологии.

При видовой идентификации стафилококков учитываются пигмент, способность гемолизировать эритроциты, продуцировать лецитиназу, коагулировать плазму. Характерная пигментация колоний патогенных стафилококков, относящиеся к виду S. aureus, определяется при их росте на селективной питательной среде, содержащей высокую концентрацию NaCl (7,5%), маннит в качестве источника углеводов и желатин. Патогенные стафилококки, дают на этой среде колонии с желтой пигментацией. Ферментацию маннита определяют путем нанесения на изолированную колонию капли раствора бромтимолового синего (0,04%). В случае смены цвета красителя на желтый реакция считается положительной. На этой же среде возможно определение способности стафилококков сбраживать желатину. Для этого на изолированную колонию наносят каплю 20% водного раствора сульфосалициловой кислоты (реакция Stone). В случае положительной реакции через 10 минут вокруг колонии появляется прозрачная зона. Для подтверждения принадлежности бактерий к виду S.aureus проводятся тесты на выявление плазмокоагулазы и ДНК-азы. ДНК-азная активность выявляется на среде DNA agar (Oxoid) путем пересева материала из подозрительных колоний штрихами от центра к краю чашки. После инкубирования нуклеазная активность стафилококков выявляется при нанесении на среду красителя толуидинового синего (0,1%), при этом вокруг колоний, образованных S. aureus, появляется зона порозовения среды. Для подтверждения принадлежности стафилококков к виду S.aureus можно также воспользоваться идентификационными системами Staphyslide – Test (BioMerioux), принцип работы которых основан на агглюцинации эритроцитов, сенсибилизированных человеческим фибриногеном. Биохимическая идентификация стафилококков проводится при помощи тест-систем API 20 Staph и RAPIDEC staph (BioMerioux).

Видовая идентификация стрептококков основана на их биохимической активности и может быть проведена при использовании тест-системы API 20 Strept (BioMerioux).

Видовая идентификация грамотрицательных неспорообразующих факультативно-анаэробных бактерий производится при помощи тест систем API 20E (BioMerioux). Оксидазопозитивные бактерии (Pseudomonas spp., Aeromonas spp. и др.) идентифицируются с помощью тест системы API 20NE (BioMerioux). Для идентификации лактозопозитивных бактерий могут быть использованы тест-системы Enterofermtub, а лактозонегативных Oxifermtub (BioMerioux, Becton Dickinson). Кроме того, для идентификации всех грамотрицательных бактерий может быть использована тест-система BBL CRYSTAL (Becton Dickinson) или полуавтоматическая система "Sceptor" (Becton Dickinson) с использованием полистироловых планшетов для видовой идентификации грамотрицательных факультативно-анаэробных бактерий.

При отсутствии вышеперечисленных тест-систем энтеробактерии могут быть идентифицированы с помощю 12 биохимических тестов, которые выявляют:

· способность энтеробактерий ферментировать глюкозу, лактозу, мальтозу,

· маннит, сахарозу;

· способность расти на цитратном агаре Симмонса;

· отношение к мочевине и молонату натрия;

· подвижность и способность продуцировать сероводород и индол.

Для видовой идентификации C.albicans, обладающей способностью продуцировать характерные для них хламидоспоры, подозрительные колонии (белые или розовые) пересевают со среды Сабуро на среду PCB (Diagnostics Pasteur) методом укола в толщу среды. Пробирки с пересевами инкубируют при комнатной температуре 24-48 часов. После инкубации определяют небольшой участок в зоне роста микроорганизмов и делают разветвленный мазок между двумя стеклами. Мазки изучают с помощью темнопольной микроскопии, при этом хламидоспоры ищут в зонах образования филаментов с находящимися на них бластоспорами. В случае отсутствия хламидоспор проводят повторный пересев. Если при этом вновь получают отрицательный результат, проводят биохимическую идентификацию дрожжеподобных грибов при помощи системы API 20C Aux (BioMerioux) или Micotube (BioMerioux, Becton Dickinson). Также видовая идентификация грибов рода Candida может быть проведена с помощью микробиологической системы Quantum (Abbot).

При идентификации гарднереллы учитывается морфология колоний на селективной питательной среде через 2-4 дня инкубации. Обычно колонии бывают выпуклыми, шарообразными с гемолизом. При микроскопии – мелкие палочки или коккобациллы, по отношению к окраске по Граму – грамвариабильные. Каталазо- и оксидазоотрицательные, продуцируют кислоту при гидролизе крахмала и мальтозы, чувствительны к метронидазолу и триметоприму.

Ориентировочная идентификация лактобактерий проводится микроскопическим методом (окраска мазка по Граму), которая позволяет оценить морфологию клеток. В мазках лактобактерии имеют вид прямых палочек, расположенных в виде блоков, не имеют спор. Бактерии рода Lactobacillus не образуют каталазы и оксидазы.

Идентификация факультативно-анаэробных лактобактерий проводится с помощью систем индикаторных бумажных для идентификации лактобактерий (СИБ-Л) и планшета биохимического, дифференцирующего лактобактерии (ПБДЛ) (НИИЭМ, г. Нижний Новгород). Идентификации подвергаются грамположительные каталазоотрицательные палочки, выросшие через 48 часов на среде MRS. Для выделения чистой культуры проводится двукратное пассирование отдельных колоний. Дифференциация основана на выявлении ферментативных свойств штаммов по их действию на углеводы и многоатомные спирты (глюкоза, меллибоза, манноза, мелецитоза, рамноза, салицин). Учет результатов проводится через 72 часа инкубации при температуре +37⁰С. Интерпритация результатов биохимического тестирования производится при помощи таблиц биохимических свойств лактобактерий.

Анаэробные штаммы лактобактерий идентифицируются с помощью полуавтоматической системы "Sceptor" (Becton Dickinson), после предварительного исключения способности тестируемых бактерий к спорообразованию.

Ориентировочная идентификация облигатно-анаэробных грамотрицательных бактерий проводится по следующим критериям: рост в присутствии желчи (диски 5 мг, BioMerioux), бриллиантового зеленого (диски 100 мкг, BioMerioux) и канамицина (диски 1000 мкг, BBL, Becton Dickinson), ферментация глюкозы, наличие черного пигмента. Используя эти тесты, бактерии делят на 4 группы:
1 группа - Bacteroides fragilis. Все бактерии этой группы сбраживают глюкозу и способны расти в присутствии желчи и канамицина, бриллилантовый зеленый подавляет их рост;
2 группа – бактерии рода Prevotella. Бактерии этой группы растут в присутствии канамицина, но не растут в присутствии желчи и бриллиантового зеленого, обладают сахаролитической активностью – сбраживают глюкозу. Некоторые виды могут образовывать черный пигмент на кровяных средах после 5-7 дней инкубации;
3 группа – род Porphyromonas. Асахоролитические бактерии, не растущие в присутствии желчи и бриллиантового зеленого, но растущие в присутствии канамицина, образуют черный пигмент. Бактерии этой группы чувствительны еще и к ванкомицину (диски 5 мкг, BBL, Becton Dickinson).
4 группа – бактерии рода Fusobacterium. Эти бактерии не растут в присутствии желчи и канамицина, но растут в присутствии бриллиантового зеленого.

Для выявления группы Prevotella melaninogenica/ Porphyromonas asacharolytica и некоторых других строгих анаэробов (Fusobacterium spp., Clostridium dificile) первичные посевы возможно исследовать в лучах длинноволнового ультрафиолетового излучения, при использовании люминисцентного микроскопа с фильтрами ФС 1-2 и СЗС 24-4. При наличии микроорганизмов группы Pr.melaninogenica / P.asacharoliticus колонии светятся малиновым цветом. Зеленое свечение характерно для Fusobacterium spp. или Clоstridium dificile.

Финальная идентификация облигатно-анаэробных грамотрицательных бактерий проводится с применением биохимической идентификационной системы для этих бактерий API (BioMerioux), а также на полуавтоматической системе "Sceptor" (Becton Dickinson) c использованием полистироловых планшетов для грамотрицательных облигатно-анаэробных бактерий.

Грамположительные анаэробные кокки могут быть идентифицированы на основании их чувствительности к новобиоцину (диски 25 мкг) и по их биохимическому профилю с применением биохимической идентификационной системы rapid ID32 A (API – BioMerioux) или полуавтоматической системы "Sceptor" (Becton Dickinson) с использованием полистироловых планшетов для видовой идентификации грамположительных анаэробных кокков.

Ориентировочная идентификация бифидобактерий проводится микроскопическим методом (окраска мазка по Граму), который позволяет оценить морфологию клеток. В мазках бифидобактерии обычно имеют вид прямых или разветвленных палочек X,Y и V-образной формы с утолщениями на концах. Бактерии рода Bifidobacterium синтезируют фермент фруктозо-6-фосфатфосфокетолазу (Ф6-ФФК), не образуют индол и каталазу, не восстанавливают нитраты, не сбраживают адонит (рубит), дульцит, эритрит, глицерин, рамнозу и альфа-метил-D-маннозид.

Биохимическая идентификация клостридий может быть осуществлена при помощи идентификационных систем API 20A или RapID Ana II (BioMerioux).

Видовая идентификация гарднерелл проводится по морфологическим критериям (окраска по Граму –грамвариабельные коккобациллы) и на основании биохимической идентификации при помощи идентификационных систем API 20 Strep или API Zym (BioMerioux).

Ввиду отсутствия единых представлений о показателях нормы из-за, прежде всего, технической сложности культивирования облигатно-анаэробных и микроаэрофильных микроорганизмов в настоящее время не определены четкие критерии нормоценоза вагинальной микрофлоры, пограничных состояний и БВ. Чаще всего при бактериологической диагностике вагинального отделяемого используются следующие критерии:
Нормоценоз

· общее количество микроорганизмов в вагинальном отделяемом составляет 10⁶-10⁸ КОЕ/мл;

· абсолютное преобладание лактобактерий;

· условно-патогенные микроорганизмы в низком титре - <10⁴ КОЕ/мл;

Бактериальный вагиноз

· массивное микробное обсеменение вагинального отделяемого с общим количеством микроорганизмов, превышающим 10⁹ КОЕ/мл;

· отсутствие лактобактерий или резкое снижение их титра до 10⁴ КОЕ/мл и менее;

· полимикробный характер микрофлоры с абсолютным преобладанием облигатно-анаэробных микроорганизмов и G.vaginalis [17].

При проведении классического бактериологического исследования необходимо учитывать тот факт, что само по себе обнаружение отдельных видов облигатных анаэробов и G.vaginalis не всегда равнозначно микробиологическому диагнозу БВ, т.к. G.vaginalis и облигатно-анаэробные микроорганизмы могут быть частью индигенной микрофлоры. Поэтому, бактериологический анализ должен, в первую очередь, основываться на интегральной оценке микрофлоры с учетом не только ее видового и количественного состава, но и количественного соотношения отдельных ее компонентов.