Если светопоглощение анализируемого раствора измеряют по отношению к среде сравнения (раствор сравнения, диафрагма, оптический клин), оптическая плотность А которой существенно больше нуля (например, А = 0,1—1,0), то такой спектрофотометрический метод называют дифференциальной спектрофотометрией, или дифференциальным фотометрическим анализом.

Одно из основных достоинств дифференциальной спектрофотометрии состоит в уменьшении ошибки спектрофотометрических определений. Поэтому дифференциальную спектрофотометрию иногда называют прецизионной спектрофотометрией.

Дифференциальная спектрофотометрия используется, в частности, при получении ИК спектров поглощения таких веществ, у которых наблюдается большое общее рассеивание света, вследствие чего светопропускание в ИК области сильно понижается (иногда до 10—20%), спектры получаются нечеткими, полосы поглощения трудно идентифицируются. Для устранения этого явления в канал сравнения вводят диафрагму, перекрывающую часть светового потока. При этом шкала пропускания расширяется и ИК спектры поглощения получаются более четкими, полосы поглощения идентифицируются надежно.

Среди различных вариантов дифференциальной спектрофотометрии в аналитической практике распространен простой способ, когда оптическую плотность анализируемого раствора измеряют по отношению к раствору сравнения, содержащему то же определяемое вещество, что и анализируемый раствор, но с несколько меньшей концентрацией. В этом случае измеряемая относительная оптическая плотность А_х равна разности оптической плотности анализируемого раствора и оптической плотности А₀ раствора сравнения.

Метод используют тогда, когда концентрация раствора — большая (десятки процентов) и оптическая плотность — высока. При высокой оптической плотности возрастает ошибка непосредственных спектрофотометрических определений. Применение же раствора сравнения, также содержащего определяемое вещество, позволяет уменьшить измеряемую относительную оптическую плотность А_х анализируемого раствора, расширить протяженность шкалы светопропускания и снизить ошибку определений до нескольких десятых долей процента.

Наименьшую ошибку получают тогда, когда разность оптических плотностей измеряемого раствора и раствора сравнения минимальна, а оптическая плотность раствора сравнения — высокая, вплоть до А = 1. Однако на практике все же приходится избегать применение раствора сравнения с очень высоким светопоглощением, так как при этом уменьшается энергия светового потока, попадающего в приемник излучения, вследствие чего работа приемника излучения становится менее устойчивой, уменьшается отношение сигнал: шум (уровень шумов обусловлен особенностями конструкции спектрофотометра). Для увеличения энергии светового потока приходится увеличивать ширину щели спектрофотометра.

Сущность метода состоит в следующем. Готовят ряд (пять—десять) эталонных растворов определяемого вещества с различной, точно заданной концентрацией с₀, с₁, с₂, ..., с_n. Вначале при выбранной длине волны в оба канала спектрофотометра помещают одинаковые кюветы с одним и тем же эталонным раствором (концентрация определяемого вещества равна с₀), относительно которого будут проводить последующие измерения, и устанавливают шкалу оптической плотности в положение А = 0.

Затем при той же постоянной аналитической длине волны измеряют оптическую плотность А_i (i = 1; 2; ...; n) каждого эталонного раствора и оптическую плотность А_х анализируемого раствора относительно эталонного раствора с концентрацией с₀ и собственной оптической плотностью А₀ (относительно чистого растворителя), после чего находят концентрацию с_х определяемого вещества в анализируемом растворе следующими способами.

Расчетный способ. При этом способе предполагается выполнимость основного закона светопоглощения. В соответствии с этим законом можно написать:

А_х = e l(с_х – с₀),

c_x – c₀ = A_x / e l,

c_x = c₀ + A_x / e l

где e — молярный коэффициент погашения определяемого вещества, l — толщина поглощающего слоя. Если ввести фактор пересчета

F = l / el,

то последнее уравнение можно переписать в виде:

c_x = c₀ + F A_x

Это уравнение и используют для расчета концентрации с_х определяемого вещества на основании измерения А_х и при известной концентрации с₀ эталонного раствора сравнения.

Рис. 4. Градуировочный график в методе дифференциальной спектрофотометрии для нахождения концентрации с_х определяемого вещества в растворе по измеренной оптической плотности А_х

Фактор пересчета F находят по результатам измерений оптических плотностей А_i эталонных растворов относительно эталонного раствора с концентрацией с₀:

А_i = e l(с_i – с₀),

F = 1 / e l = (c_i – c₀) / A_i

Рассчитывают среднее значение фактора пересчета

где п — число измеренных эталонных растворов.

Способ градуировочного графика. По полученным экспериментальным значениям A_i строят градуировочный график, откладывая по оси абсцисс известные величины концентрации эталонных растворов с_i, а по оси ординат — значения оптической плотности А_i эталонных растворов, измеренной относительно эталонного раствора с концентрацией с₀ (рис. 4). По этому графику, зная измеренное значение А_х, находят концентрацию с_х определяемого раствора.

Часто строят серию градуировочных графиков, используя каждый раз в качестве раствора сравнения эталонный раствор с постепенно увеличивающейся концентрацией определяемого вещества, с тем чтобы подобрать такой раствор сравнения, концентрация которого была бы наиболее близкой к концентрации анализируемого раствора.

Способом градуировочного графика можно пользоваться и тогда, когда наблюдаются отклонения от основного закона светопоглощения.

Дифференциальная спектрофотометрия в разных вариантах применяется при определении ряда металлов и неметаллов, органических соединений, лекарственных веществ. Так, разработаны варианты анализа методом дифференциальной спектрофотометрии многих двухкомпонентных смесей лекарственных веществ: кофеин и аспирин, кофеин и амидопирин, кофеин и фенацетин, теобромин и барбамил, теофиллин и барбамил, папаверина гидрохлорид и дибазол, папаверина гидрохлорид и кислота никотиновая — и т. д.

Аналогичные методы применяются и в дифференциальной фотоэлектроколориметрии. [1 – 3]