Лаборатории, использующие методы амплификации нуклеиновых кислот, должны иметь санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения работ с возбудителями III-IV группы патогенности, работа организуется согласно СП 1.3.2322-08, МУ 1.3. 2569 -09.

Лаборатория в соответствии с этапами проведения анализа должна включать рабочую зону 1 (приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала), рабочую зону 2 (для выделения (экстракции) нуклеиновых кислот), рабочую зону 3 (для проведения реакции амплификации и учета ее результатов).

Рекомендуется разделить рабочую зону 3 на две подзоны (3а и 3б) и разместить их в отдельных помещениях. В подзоне 3а осуществляют приготовление реакционных смесей, в подзоне 3б проводят амплификацию нуклеиновых кислот и учет результатов амплификации при использовании гибридизационо – флуоресцентного метода детекции.

Оборудование, реагенты, средства дезинфекции, лабораторная посуда и расходные материалы.

Рабочая зона 1

1. Бокс биологической безопасности III класса защиты или бокс биологической безопасности II класса защиты.

2. Центрифуга для пробирок объемом 5 - 100 мл до 3 тыс. об/мин.

3. Микроцентрифуга / вортекс.

4. Настольная центрифуга для микропробирок (типа «Эппендорф» или аналоги) объемом 1,5 -2 мл до 10000g.

5. Твердотельный термостат для пробирок объемом 1,5 мл с диапазоном рабочих температур 25– 100 ⁰С.

6. Термостатируемый шейкер для пробирок.

7. Отдельный набор автоматических пипеток переменного объема.

8. Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся микропробирки на 1,5 мл или 2,0 мл.

9. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с фильтром до 200 и до 1000 мкл.

10. Штативы для наконечников, микропробирок объемом 1,5 мл.

11. Комбинированный холодильник с камерами, поддерживающими температуру от 2 до 8 ⁰С и не выше минус 16 ⁰С (для хранения исследуемого материала). Возможно, отдельное использование холодильника с камерой поддерживающей температуру от 2 до 8 ⁰С и морозильника, с камерой поддерживающей температуру не выше минус 16 ⁰С.

12. Морозильная камера на минус 70 ⁰С (при необходимости, в случае длительного хранения материала).

13. Емкость с регламентируемым дезинфицирующим раствором.

14. Емкость с 70 % этиловым спиртом.

Рабочая зона 2

1. Бокс биологической безопасности II или III класса биологической защиты.

2. Микроцентрифуга / вортекс.

3. Настольная центрифуга для микропробирок (типа «Эппендорф» или аналоги) объемом 1,5 -2 мл до 10000g.

4. Твердотельный термостат для пробирок объемом 1,5 мл с диапазоном рабочих температур 25 - 100 ⁰С.

5. Вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой.

6. Отдельный набор автоматических пипеток переменного объема.

7. Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся пробирки объемом 1,5 мл или 2,0 мл.

8. Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема до 200 мкл.

9. Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с фильтром до 100, 200 и до 1000 мкл.

10. Штативы для наконечников, микропробирок на 1,5 мл.

11. Холодильник с камерами, поддерживающими температуру от 2 до 8 ⁰С и не выше минус 16 ⁰С (для хранения наборов, предназначенных для выделения нуклеиновых кислот). Возможно отдельное использование холодильника с камерой, поддерживающей температуру от 2 до 8 ⁰С и морозильника, с камерой поддерживающей температуру не выше минус 16 ⁰С.

12. Холодильник с камерой, поддерживающей температуру от 2 до 8 ⁰С (для хранения препаратов нуклеиновых кислот). Не допускается хранение препаратов нуклеиновых кислот в одном холодильнике с компонентами набора для выделения нуклеиновых кислот;

13. Емкость с дезинфицирующим раствором.

14. Отдельный халат, шапочки, обувь и одноразовые перчатки по МУ 1.3.2569-09.

15. Одноразовые пластиковые контейнеры для сброса и инактивации материалов.

16. Допускается использование автоматизированного оборудования для выделения нуклеиновых кислот.

17. Коммерческие наборы реагентов зарегистрированные и разрешенные для использования в РФ в установленном порядке.

Рабочая зона 3

1. Бокс биологической безопасности II и III класса или настольный бокс с бактерицидной лампой (ПЦР-бокс; УФ-бокс).

2. Программируемые термоциклеры (персональные, многомодульные, с функцией амплификации в режиме «реального времени») и автоматизированные станции. Выбор термоциклера или автоматизированной станции определяется методами амплификации нуклеиновых кислот и коммерческими наборами реагентов, используемыми в лаборатории, характером выполняемых задач и финансовыми возможностями.

4. Микроцентрифуга / вортекс.

5. Отдельный набор автоматических пипеток переменного объема.

6. Одноразовые полипропиленовые пробирки для амплификации объемом 0,5 (0,2) мл.

7. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с фильтром до 10 мкл, 100 мкл и 200 мкл, свободные от ДНКаз.

8. Штативы для наконечников, микропробирок на 0,5 (0,2) мл.

9. Холодильник с камерами, поддерживающими температуру от 2 до 8 ⁰С и от минус 18⁰С до минус 25 ⁰С (для хранения наборов, предназначенных для проведения обратной транскрипции и амплификации нуклеиновых кислот). Возможно отдельное использование холодильника с камерой, поддерживающей температуру от 2 до 8 ⁰С и морозильника с камерой, поддерживающей температуру от минус 18⁰С до минус 25 ⁰С.

10. Емкость для сброса отработанных расходных материалов.

11. С целью автоматизации процедуры приготовления реакционных смесей для амплификации допускается использование автоматизированного оборудования для раскапывания реагентов.

12. Коммерческие диагностические наборы реагентов (тест-ситемы) зарегистрированные и разрешенные для использования в РФ в установленном порядке.

Этап пробоподготовки

Некоторые виды биологического материала, перечисленные в данном разделе, требуют предварительной обработки перед проведением исследования.

Мокрота или аспират из трахеи. Вязкая по консистенции мокрота подлежит обработке реагентом, разрушающим мукополисахариды (например, препаратом «муколизин» или аналогом). С целью снижения вязкости в емкость с мокротой добавляется равное количеству мокроты количество реагента. После инкубации при комнатной температуре до просветления мокроты (не более 20 минут) 100 мкл мокроты используют для экстракции ДНК. При необходимости повторного проведения анализа остаток обработанной мокроты замораживают.

Бронхоальвеолярный лаваж или промывные воды бронхов. Образец перемешивают переворачиванием в исходной емкости. Автоматическим дозатором, используя наконечник с фильтром, отбирают 1 мл образца и переносят в пробирку объемом 1,5 мл для проведения центрифугирования при 10 тыс об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость аккуратно отбирают, используя наконечник с фильтром, оставляя над осадком 200 мкл жидкости, в которой ресуспендируют осадок. Полученную суспензию (100 мкл) используют для экстракции ДНК. При необходимости повторного проведения анализа оставшийся материал замораживают.

Cекционный материал гомогенизируют с использованием стерильных фарфоровых ступок и пестиков, затем готовят 10 % суспензию на стерильном физиологическом растворе или фосфатном буфере. Суспензию переносят в пробирку на 1,5 мл и центрифугируют при 10 тыс об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость (100 мкл) используют для экстракции ДНК. При необходимости повторного проведения анализа остаток суспензии замораживают.