Замена модифицированного нуклеотида обычно происходит в четыре этапа. Во-первых, фермент распознает этот нуклеотид и надрезает полинуклеотидную цепь вблизи него либо разрывает гликозидную связь между модифицированным основанием и дезоксирибозой. Во-вторых, экзонуклеаза удаляет модифицированный нуклеотид и/или соседние нуклеотиды, оставляя небольшую брешь. В-третьих, удаленный участок синтезируется заново с 3-ОН-конца с использованием в качестве матрицы противоположной цепи. В-четвертых, концы разрыва, образовавшиеся в результате репарации, соединяются с восстановлением ковалентной целостности репарированной цепи.

Сайты, в которых произошла депуринизация или депиримидинизация, выщепляются ферментами, называемыми АР-эндонуклеазами. В клетках про - и эукари - от имеется много разнообразных АР-эндонуклеаз, часто по нескольку разных типов. Некоторые АР-эндонуклеазы надрезают цепь с 3'-стороны АР-сайта, а другие расщепляют диэфирную связь с 3'-сто-роны; в любом случае образуются 3'-гидроксильный и 5'-фосфорильный концы. Разрыв фосфодиэфирной связи по одну или другую сторону от места нарушения позволяет экзонуклеазе удалить прилегающие остатки по обе стороны сайта расщепления и затем ресинтезировать удаленную последовательность.

В репарации N-алкилированных пуринов и других модифицированных оснований ключевую роль играют специфические N-гликозилазы - ферменты, расщепляющие гликозидную связь между модифицированными основаниями и дезоксирибозой. N-гликозилазы используются и при коррекции нарушений, состоящих в спонтанном дезамини-ровании цитозина или аденина и превращении их соответственно в урацил или гипоксантин. Ферменты урацил-гликозилаза и гипоксантин-гликозилаза выщепляют из ДНК соответственно урацил и гипоксантин, оставляя пробелы в месте выщепления. И вновь с помощью механизма выщепления-ресинтеза восстанавливается исходная последовательность поврежденной цепи.

Урацил-гликозилаза играет очень важную антимутагенную роль и при исправлении ошибок, происходящих при использовании во время репликации dUTP вместо dTTP. Поскольку спаривание dUMP с матрицей происходит почти так же хорошо, как и dTMP, Pol III его не распознает, и если dUMP не подвергается специфическому выщеплению, то при последующем раунде репликации в новую цепь может включиться dGMP. Таким образом, г-гликозилаза защищает клетки от возможных мутагенных последствий включения в цепь ДНК dUMP.

Репарация тиминовых димеров может происходить и в темноте одним из следующих двух способов. В клетках Е. coli синтезируются три полипептида, кодируемые генами uvrA, uvrB и uvrC, которые образуют ферментный комплекс uvrЛВC-эндонуклеазу. Этот фермент разрезает цепь ДНК, содержащую пиримидиновый димер, на расстоянии восьми фосфодиэфирных связей с 5'-стороны и четырех или пяти связей с 3'-стороны пиримидинового димера. Удаление поврежденного участка, по-видимому, катализируется геликазой, кодируемой еще одним геном, uvrD. В результате удаляется тиминовый димер и еще примерно 12 окружающих его нуклеотидов. Образовавшийся пробел заполняется с помощью Pol I, а ДНК-лигаза завершает репарацию, соединяя два соседних основания цепи. Некоторые организмы используют для репарации повреждений, возникающих при образовании пиримидиновых димеров, другой механизм. Репарация осуществляется при участии пиримидиновый димер-г-гликозилазы, которая создает апиримидиновый сайт. Гликозидная связь между одним из тиминов и дезоксирибозой разрезается так, что тиминовый димер остается на 5'-конце разорванной цепи, а 3'-ОН-группа - на дезоксирибозе. Образовавшийся 3'-АР-конец отщепляется с помощью 3'-5'-экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы, а затем путем ник-трансляции и лигирования удаляется нуклеотид вместе с прилежащим тиминовым димером, заполняется образовавшийся пробел и сшиваются концы цепи.

В. Значение репарации ДНК

У клеток в процессе эволюции выработался сложный механизм устранения повреждений, возникающих в ДНК под действием самых разнообразных химических и физических факторов, а также вследствие ошибок при репликации или рекомбинации. И это вполне понятно: большая часть повреждений блокирует передачу генетической информации последующему поколению, а остальные, если их не устранить, сохранятся в геномах потомков и приведут к драматическим изменениям в молекулах белков, а том числе и ферментов, необходимых для поддержания жизнедеятельности клетки. При повреждении определенных звеньев системы репарации клетки становятся особенно уязвимыми для некоторых химических и физических агентов. Например, клетки Е. coli, у которых нарушена система внесения разрывов в ДНК при выщеплении тиминовых димеров, очень чувствительны к УФ-свету. Клетки, неспособные осуществить ту или иную N-гликозилазную реакцию, гораздо больше, чем нормальные, подвержены мутагенному или летальному эффекту алкилирующих агентов или ионизирующей радиации. У клеток Е. coli, дефектных по Pol I, существенно снижена выживаемость при облучении низкими дозами УФ-света.

У представителя низших эукариот Saccharomyces cerevisiae имеется по крайней мере пять генов, кодирующих белки, которые участвуют во внесении разрывов в УФ-облученную ДНК. Нарушение только в одном из этих пяти RAD-генов приводит к тому, что клетки утрачивают способность к внесению разрывов в ДНК и, следовательно, к удалению пиримидиновых димеров. У дрожжей существуют также мутанты с нарушенной способностью к удалению сшивок между цепями, хотя элиминация УФ-индуцированных повреждений проходит нормально. Это предполагает, что у дрожжей, как и у человека, для удаления поперечных сшивок, а возможно, и для исправления множества других химических модификаций в ДНК существуют специфические, весьма сложные механизмы репарации.

Люди, страдающие пигментной ксеродермой, очень чувствительны к ультрафиолетовому свету, и у них развиваются разные формы рака кожи даже при очень слабом воздействии солнечного света. Клетки таких людей несут мутацию, сходную с RAD-мутацией дрожжей и проявляющуюся в том, что у них нарушена способность к выщеплению пиримидиновых димеров из УФ-облученной ДНК. Заболевание может быть обусловлено мутацией в одном из по крайней мере девяти генов, что говорит о достаточно сложном механизме репарации ДНК, содержащей тиминовые димеры, у человека. Как правило, заболевание бывает связано с неспособностью к выщеплению тиминовых димеров. Если к облученным клеткам в культуре добавить фермент, обладающий тиминдимергликозилазной и АР-эндонуклеазной активностями, то УФ-повреждения могут быть устранены.

Рекомбинация ДНК

Генетическая рекомбинация включает несколько связанных между собой процессов, в результате которых в клетках или организмах, где они происходят, создаются новые комбинации элементов носителей генетической информации. Рекомбинация между близко расположенными гомологичными хромосомами приводит к интенсивной перетасовке отцовских и материнских генов в ходе мейоза и тем самым создает предпосылки для эволюционной проверки новых комбинаций этих генов в потомстве. Как правило, рекомбинационные события, происходящие в соматических клетках либо во время репликации ДНК, либо после нее и проявляющиеся в виде обмена сестринских хроматид, не приводят к изменению генотипа или фенотипа клетки. Однако нередко они порождают различные геномные перестройки. Это, например, утрата, приобретение или амплификация генетических элементов и установление новых взаимосвязей между уже имеющимися, но по-новому расположенными элементами.

Если использовать молекулярные термины, то можно сказать, что генетическая рекомбинация состоит в образовании ковалентных связей между нуклеотидными последовательностями из разных областей одной и той же или разных молекул ДНК.

Все клетки и многие вирусы содержат информацию о синтезе ферментов, предназначенных не только для репарации повреждений в собственной ДНК, но и ферментов, осуществляющих рекомбинацию. На самом деле некоторые ферменты, участвующие в репликации и репарации ДНК, играют ключевую роль и при рекомбинации. В этом разделе мы рассмотрим механизмы некоторых рекомбинационных процессов и ферменты, которые их катализируют. Особое внимание будет обращено на рекомбинацию у бактерий и фагов, поскольку у них эти процессы довольно хорошо изучены. Несмотря на то что генетические и морфологические аспекты рекомбинации в эукариотических клетках известны, на молекулярном уровне здесь многое остается неясным.

А. Типы рекомбинации

Существуют три типа рекомбинации: общая, или гомологичная, сайт-специфическая и случайная, или негомологичная.

Общая рекомбинация. Общая рекомбинация происходит, как правило, между протяженными участками идентичных или гомологичных нуклеотидных последовательностей. Ее часто называют гомологичной рекомбинацией или кроссинговером. При общей рекомбинации происходит разрыв двух гомологичных участков ДНК, и каждый из концов одного сегмента соединяется с соответствующими концами другого таким образом, что обе образующиеся молекулы содержат разные фрагменты обеих участвующих в рекомбинации ДНК. На самом деле сайты, по которым происходят разрыв и воссоединение каждой из двух цепей, очень часто не совпадают.

Обычно общая рекомбинация происходит между гомологичными и аллельными участками разных молекул ДНК, но она может произойти и между гомологичными, но неаллельными областями ре-комбинирующих молекул. В этом случае один из продуктов рекомбинации утрачивает часть ДНК, а другой приобретает "лишний" сегмент. Такой процесс получил название неравного кроссинговера. Иногда рекомбинация происходит между неаллельными участками одной и той же хромосомы с соответствующей потерей области, лежащей между сайтами рекомбинации. В отличие от уже рассмотренных случаев некоторые рекомбинационные события нереципрокны; как следствие, один из образовавшихся продуктов идентичен одной из исходных молекул, а другой отличается от обоих партнеров. Такой процесс часто называется генной конверсией.

Сайт-специфическая рекомбинация. Рекомбинация называется сайт-специфической, если сайты разрыва и воссоединения в двух рекомбинирующих молекулах или двух фрагментах одной и той же молекулы ДНК находятся в пределах довольно коротких специфических гомологичных нуклеотидных последовательностей - как правило, не более 25 нуклеотидов. Такие короткие последовательности может иметь только один из партнеров или оба. В качестве примера первого варианта можно привести транспозиции некоторых мобильных элементов у эу - и прокариот, а второго - процесс интеграции-выщепления ДНК фага X из хромосомы Е. coli. С помощью сайт-специфической рекомбинации происходят запрограммированные перестройки хромосомной ДНК при смене типов спаривания у дрожжей; она ответственна также за разнообразие антител. По-видимому, общая рекомбинация между любыми парами гомологичных последовательностей осуществляется с помощью одного и того же комплекса ферментов; с другой стороны, для каждого случая сайт-специфической рекомбинации необходим свой набор ферментов. Негомологичная рекомбинация. Рекомбинация между негомологичными нуклеотидными последовательностями происходит в клетках прокариот и дрожжей достаточно редко, а в клетках млекопитающих - весьма часто. К негомологичной рекомбинации можно отнести процесс случайного встраивания вирусной или плазмидной ДНК в ДНК клеток животных, в результате чего в реплицирующихся геномах паповавирусов появляется множество делеций и дупликаций. Концы разорванной ДНК могут соединиться, даже если они негомологичны. В некоторых случаях рекомбинация происходит между последовательностями, содержащими несколько гомологичных пар оснований, или между короткими частично гомологичными участками. Но, как правило, рекомбинирующие сегменты не имеют гомологичных последовательностей.