| Частота генотипа (%) среди | Частота аллеля (%) среди | ||||||
| Фенотип | Генотип | Аллель | |||||
| шведов | негров | шведов | негров | ||||
| (n=100) | (n=100) | ||||||
| Fy(a +b −) | Fy a / Fy a | 21 | 0 | Fy a | 41 | 3 | |
| Fy a / Fy | 0 | 4 | Fy b | 59 | 15,5 | ||
| Fy(a +b + ) | Fy a / Fy b | 40 | 2 | Fy | 0 | 79,5 | |
| Fy(a −b + ) | Fy b / Fy b | 39 | 2 | ||||
| Fy b / Fy | 0 | 29 | |||||
| Fy(a −b −) | Fy / Fy | 0 | 63 | ||||
606
Гены Fy a и Fy b наследуются кодоминантно. При обследовании членов 1091 семьи с помощью сывороток анти-Fy a и анти-Fy b ожидаемая и фактическая ча-стота фенотипов Duffy совпала (Chown и соавт. [35], Lewis и соавт. [92]).
Среди 1445 обследованных жителей Москвы 1077 (74,84 %) были Fy a-положительными, 368 (25,16 %) – Fy a-отрицательными (Т.М. Пискунова [6]).
Молекулярная основа
Секвенирование ДНК ретикулоцитов показало, что специфичность антиге-нов Fy a и Fy b обусловлена заменой нуклеотидов в позиции 125, которая приво-дит к замене глицина на аспарагин в положении 42 гликопротеина Fy (Adams и соавт. [9], Chaudhuri и соавт. [29], Iwamoto и соавт. [79], Mallinson и соавт. [99], Tournamille и соавт. [164]) (табл. 10.4). Результаты этих исследований подтверж-дены трансфекцией соответствующих кодирующих ДНК-клонов в клетки ли-нии COS-7 обезьян. В результате трансфекции указанные клетки начинали экс-прессировать антигены Fy a и Fy b, что можно было выявить с помощью проточ-ной цитофлюориметрии (Tournamille и соавт. [164]). Участок рестрикции алле-ля Fy a обозначен BanI.
Замена Ala 100 Thr в домене 2, обусловленная мутацией G 298 A, не влияла на специфичность антигенов.
Как показали Olsson и соавт. [128], у доноров шведов, имевших фенотип Fy(a −b + ), гликопротеин Fy в позиции 100 содержал треонин. Среди доноров Fy(a +b −) лиц с аналогичным размещением треонина в гликопротеине Fy не об-наружено.
| Таблица 10.4 | |||||
Аллели, изменяющие экспрессию антигенов Duffy на эритроцитах
Аллели
Нуклеотид
аминокислота
аминокислота
аминокислота
локуса Fy
в позиции 67
в положении 42
в положении 89
в положении 100
Fy a
T
Глицин
Аргинин
Аланин
Fy b
T
Аспарагин
Аргинин
Aланин или треонин
Fy x
T
Аспарагин
Цистеин
Треонин
Fy
C
Аспарагин
Аргинин
Аланин
Гликопротеин Fy, гомологичный на 99 % гликопротеину Fy человека, най-ден у шимпанзе. У обезьян Macacus rhesus, сурков и белок гомология состави-ла 93–94 % (Chaudhuri и соавт. [29]). Все без исключения приматы имели ген, кодирующий в положении 42 аспарагин, из чего был следовал вывод, что ал-лель Fy a в эволюции человека появился раньше (Chaudhuri и соавт. [29], Li и соавт. [93]).
607
Действие ферментов
Антигены Fy a и Fy b разрушаются большинством протеолитических фермен-тов: папаином, фицином, бромелином, проназой и химотрипсином. Трипсин не влияет на указанные антигены (Judson, Anstee [83], Miller и соавт. [110], Morton [116]). Обработка эритроцитов сиалидазой также не сказывается на факторах Fy a и Fy b. Ранние сообщения о влиянии трипсина на антигены системы Duffy были обусловлены, как полагают Daniels [43] и Issitt, Anstee [76], искажением результатов из-за примеси химотрипсина.
Хранение нативных эритроцитов в изотоническом растворе хлорида натрия при 12 оС в течение 2 недель приводит к частичой утрате антигенной активно-сти факторов Fy a, Fy b, Fy3 и других Fy-субстанций, специфически ингибирую-щих соответствующие антитела (Williams и соавт. [179]).
Фенотип Fy x
Фенотип Fy x проявляет себя наличием необычного антигена Fy b, который реа-гирует не со всеми образцами сывороток анти-Fy b. Специфических антител анти-Fy x не найдено. Это свидетельствует в пользу того, что антиген Fy x как самосто-ятельная единица не существует. Тем не менее признак Fy x наследуется кодоми-нантно, так же как Fy a и Fy b (Chown и соавт. [34, 35], Lewis и соавт. [92]).
Некоторые образцы сывороток анти-Fy a реагируют слабо с эритроцитами Fy a Fy x (Chown и соавт. [35], Lewis и соавт. [92]). По адсорбции – элюции высо-коактивных анти-Fy b-антител можно отличить лиц, имеющих генотип Fy b / Fy b от лиц, имеющих генотип Fy b / Fy x, однако более четкие результаты получают при использовании ПЦР (Murphy и соавт. [121]).
Фенотип Fy x [Fy(a +b w)] описывали главным образом у лиц белой расы, среди которых он встречается не столь редко. Среди 1108 обследованных 11 человек были Fy(a +b w), 1 Fy(a −b + w); частота гена Fy x составила 0,015 (Lewis и соавт. [92]).
Фенотип Fy x описан у индейцев Канады (Buchanan и соавт. [23]). Сообщалось о нескольких лицах, которые были гомозиготны по гену Fy x. Фенотип двоих при первичном тестировании был определен как Fy(a −b −) (Cedergren, Giles [25], Cook и соавт. [39], Habibi и соавт. [58], Lewis и соавт. [92], Parasol и соавт. [131]).
Помимо супрессии антигена Fy b у гомозигот Fy x / Fy x заметно снижена вы-раженность других часто встречающихся антигенов Duffy: Fy3, Fy5 и Fy6 (Buchanan и соавт. [23], Habibi et al [58, 59], Mallinson и соавт. [99], Marsh [101], Olsson и соавт. [128], Tournamille и соавт. [162], Yazdanbakhsh и соавт. [183]). Подсчет антигенных участков Fy6 с помощью проточной цитофлюориметрии показал, что их количество на эритроцитах Fy(a −b + ) составляет 2200–2400, на эритроцитах Fy x – от 150 до 250 (Tournamille и соавт. [162]). низкий уровень связывания антител анти-Fy6, обусловленный геном Fy x, наблюдали Tournamille
с соавт. [162], Yazdanbakhsh и соавт. [183], используя метод иммуноблоттинга. Авторы полагают, что в присутствии гена Fy x имеет место угнетение синтеза
608
гликопротеина Fy, но не конформация его молекулярной структуры с образова-нием новой специфичности.
Гены Fy a, Fy b и Fy x имеют одинаковые кодирующие последовательности за исключением одной нуклеотидной замены (С 265 Т), приводящей к заме-щению Arg 89 Cys (Gassner и соавт. [53], Li и соавт. [93], Olsson и соавт. [128], Tournamille и соавт. [162]) (табл. 10.4). Указанная замена затрагивает первую экстрацеллюлярную петлю гликопротеина Fy (рис. 10.1).
Рис. 10.1. Трехмерная модель Fy-гликопротеина по Mallinson и соавт. [99]. Экстрацеллюлярный домен со-держит 3 участка N-гликозилирования. Черными круж-ками отмечены 5 цистеиновых остатков.
Клетки млекопитающих, подвергнутые трансфекции кДНК-Fy с искусствен-но встроенным кодоном цистеина в позиции 89, продуцировали меньшее ко-личество субстанций Fy b, Fy3 и Fy6 по сравнению с клетками, подвергнутыми трансфекции кДНК нормальных генов Fy a и Fy b, в которых вместо Arg в пози-ции 89 присутствует Lys (Tamasauskas и соавт. [155]).
Ген Fy x кодирует треонин в позиции Ala 100 Thr, а также имеет замену С 190 Т в интроне гена FY (Gassner и соавт. [53]). Эксперименты по направлен-ному мутагенезу со встраиванием участков ДНК, кодирующих Ala 100 Thr, по-казали, что замены в этой позиции не влияют на экспрессию антигенов Duffy (Yazdanbakhsh и соавт. [183]).
Генная частота Fy x, установленная по мутации Arg 89 Cys при обследовании 100 шведов и 300 австрийцев, соответствовала 0,025 и 0,015; при обследова-нии 100 южноафриканских негров ген Fy x не обнаружен (Gassner и соавт. [53], Olsson и соавт. [128]). Тем не менее, ген Fy x проявлял некоторые признаки гете-рогенности. У одних индивидов, имеющих фенотип Fy x, последовательность,
609
кодирующая антиген Fy b, не отличалась от нормы, у других наблюдали делецию на участке SP-1, расположенном выше стартовой точки считывания (Moulds и соавт. [117]).
Фенотип Fy(a −b −)
Фенотип Fy(a −b −) был впервые выявлен Sanger и соавт. [144] при иссле-довании крови доноров (американских негров) сыворотками анти-Fy a и анти-Fy b. Оказалось, что большинство лиц указанной расовой принадлежности яв-ляются Fy(a −b −). Такие результаты позволили высказать предположение о су-ществовании рецессивного аллеля в локусе Duffy. Этот молчащий аллель полу-чил обозначение Fy. Частота фенотипа Fy(a −b −) составила 63 % среди негров Нью-Йорка, Вест-Индии (Race, Sanger [136]) и Южной Африки (Olsson и со-авт. [127]), а среди других африканских популяций она оказалась еще более вы-сокой (Mourant и соавт. [118]). Все 1168 обследованных жителей сельских райо-нов Гамбии имели фенотип Fy(a −b −) (Welch и соавт. [176]).
Данные посемейных исследований в 53 негритянских семьях позволили под-твердить первоначальное предположение о существовании молчащего аллеля Fy (Race, Sanger [136]). Эффект дозы, выявляемый некоторыми образцами антител анти-Fy a, позволил установить, что практически все европеоиды Fy(a +b −) имеют генотип Fy a / Fy a и содержат двойную дозу антигена Fy a, а негроиды имеют генотип Fy a / Fy, их эритроциты несут 1 дозу антигена Fy a и реагируют с антителами анти-Fy a менее интенсивно, чем эритроциты Fy(a + ) европеоидов (Sanger и соавт. [144]).
Хотя эритроциты Fy(a −b −) лишены Fy-гликопротеина (Chaudhuri и соавт. [28, 30]), последний у негроидов экспрессирован на клетках эндотелия постка-пиллярных венул в мягких тканях и синусах селезенки (Peiper и соавт. [132]). Транскрипты гена FY (иРНК) не были выявлены в костном мозге лиц Fy(a −b −), однако их обнаружили в других тканях (легкие, селезенка, толстая кишка) (Chaudhuri и соавт. [29]). Кодирующая последовательность аллеля Fy оказа-лась идентичной кодирующей последовательности аллеля Fy b (Chaudhuri и со-авт. [28, 29], Iwamoto и соавт. [79], Mallinson и соавт. [99], Peiper и соавт. [132], Tournamille и соавт. [164]), однако в промоторной области имелась нуклеотид-ная замена T > C, расположенная на 33 позиции выше стартовой точки считы-вания для эритроидных транскриптов, на 66 позиций выше такой же точки для образования большого транслирующего кодона (позиция 67), включая участок рестрикции StyI (Iwamoto и соавт. [78], Tournamille и соавт. [160]). Эта мута-ция внутри последовательности GATA (с заменой CTTATCT на CTTAСCT) пре-рывает связывание эритроидспецифического фактора транскрипции GATA-1 и тем самым препятствует экспрессии антигенов FY на эритроидных клетках, при этом другие типы клеток не затрагиваются.
Iwamoto и соавт. [78], Tournamille и соавт. [160] провели эксперименты по трансфекции эритроидной клеточной линии человека (HELa) и линии эн-дотелиальных клеток промоторным регионом гена Fy b и гена, кодирующего
610
хлорамфениколацетилтрансферазу (ХАТ). В клетках, подвергнутых трансфек-ции, отметили высокий уровень ХАТ-активности. Трансфекция клеток фраг-ментами ДНК, содержавшими Fy-специфическую T 33 C GATA-мутацию, не приводила к появлению ХАТ-активности в эритроидных клетках, однако в клет-ках эндотелиальной линии ее наблюдали.
Из 1062 обследованных жителей Папуа – Новой Гвинеи 23 оказались гетеро-зиготными по Fy a-специфической последовательности Gly 42 и GATA-мутации, типичной для аллеля Fy. Частота аллеля составила 0,022 (Zimmerman и соавт. [184]). По-видимому, указанный аллель ведет себя как молчащий в отношении эритроидных клеток, поскольку эритроциты таких лиц имеют слабую экспрес-сию антигена Fy6 по сравнению с эритроцитами гомозигот Fy a / Fy a.
Фенотип Fy(a −b −), типичный для негроидов, встречается крайне редко сре-ди представителей других рас и этнических групп (Mourant и соавт. [118]). Он не был найден среди 6 тыс. белых жителей Австралии при их обследовании с помощью сыворотки анти-Fy3 (Albrey и соавт. [10]).
Chown и соавт. [35], Lewis и соавт. [92] рассчитали, что частота гена Fy среди лиц белой расы составляет около 0,001; ожидаемая частота фенотипа Fy(a −b −) – 1 на 1 млн. В нескольких семьях выявлено необычное наследование генов Fy a и Fy b, обусловленное, как полагают Chown и соавт. [35], присутстви-ем аллеля Fy x.
Людей Fy(a −b −) среди европеоидов и монголоидов обычно идентифициро-вали в связи с обнаружением в сыворотках их крови активных антител анти-Fy3. У одной из австралийских женщин Fy(a −b −) имелась делеция 14 пар ко-донов гена FY (Albrey и соавт. [10]), которая изменяла рамку считывания и приводила к прекращению трансляции (Mallinson и соавт. [99]). Молекулярно-генетические методы исследования позволили выявить у 3 неродственных лиц гомозиготность по нонсенс-мутациям, приведшим к формированию фенотипа Fy(a −b −):
–– G 408 A (Trp 136 Stop) в гене Fy a у англичанки (Rios и соавт. [139]);
–– G 407 A (Trp 96 Stop) в гене Fy b у ливанской еврейки (Rios и соавт. [139]); –– G 287 A (Trp 136 Stop) в гене Fy a у индианки из Канады (Buchanan [23],
Rios и соавт. [139]).
Tsuneyama и соавт. [165] наблюдали японку Fy(a −b −), без антител, имев-шую делецию С327, которая приводила к остановке считывания 12 кодонов ниже 120-го.
Каждая из мутаций, описанных выше, проявляла себя отсутствием экспрес-сии антигенов Duffy на эритроцитах в отличие от GATA-мутаций, способству-ющих формированию африканского варианта фенотипа Fy(a −b −), при котором Duffy-гликопротеины экспрессированы на неэритроидных клетках.
Фенотип Fy(a −b −) без антител анти-Fy3 описан у чешских цыганок (Libich
в соавт. [94], Pisacka и соавт. [134]), белой женщины шотландско-швейцарского происхождения, имевшей GATA-мутацию, характерную для негроидов.
611
Гликопротеин Fy и ген Fy
Moore и соавт. [115], используя методы иммунопреципитации, установи-ли, что антиген Fy a присутствует на 3 протеинах, имеющих мол. массу 39, 64
в 85 кДа. Иммуноблоттинг с антителами анти-Fy a позволил выявить структу-
ры с мол. массой 35 – 43 (Hadley и соавт. [60]) и 40–50 кДа (Tanner и соавт. [156]). Субстрат, выделенный электроэлюцией из протеинов 35–43 кДа, ингиби-ровал антитела анти-Fy a [60]. Аналогичные результаты получили Nichols и со-авт. [124], Riwom и соавт. [140], использовавшие иммуноблоттинг с монокло-нальными антителами анти-Fy6.
Обработка эритроцитов эндо-F-гликаназой, N-гликаназой и сиалидазой сни-жала мол. массу выделяемых с помощью иммуноблоттинга Fy-гликопротеинов до 4 кДа (Hadley и соавт. [60], Tanner и соавт. [156]).
Riwom и соавт. [140] и Wasniowska и соавт. [172] выделили низкомолеку-лярные фракции из очищенных Fy-гликопротеинов и третичных структур, по-лученных из них. Указанные исследования свидетельствовали о том, что Fy-гликопротеины N-гликозилированны и слабо О-гликозилированы. Разная сте-пень N-гликозилирования, вероятно, и обусловливает колебания мол. массы Fy-гликопротеинов в широком диапазоне (Chaudhuri и соавт. [30]).
Chaudhury и соавт. [30] посредством иммунопреципитации моноклональны-ми антителами анти-Fy6 выделили Fy-гликопротеин с мол. массой 36–43 кДа вместе с олигомерами большей мол. массы, последние также реагировали с ука-занными антителами. Другие из сопутствующих протеинов не реагировали в реакции иммунного окрашивания с антителами анти-Fy6. Картирование пепти-дов, выделенных из эритроцитов Fy(a +b −) и Fy(a −b + ), существенных различий не выявило (рис. 10.2).
MGNCLHRAEL SPSTENSSQL DFEDVWNSSY GVNDSFPDGD YDANLEAAAP 50 CHSCNLLDDS ALPFFILTSV LGILASSTVL FMLFRPLFRW QLCPGWPVLA 100 QLAVGSALFS IVVPVLAPGL GSTRSSALCS LGYCVWYGSA FAQALLLGCH 150 ASLGHRLGAG QVPGLTLGLT VGIWCVAALL TLPVTLASGA SGGLTCLIYS 200 TELKALQATH TVACLAIFVL LPLGLFGAKG LKKALGMGPG PWMNILWAWF 250
| IFWWPHGVVL | GLDFLVRSKL | LLLSTCLAQQ | ALDLLLNLAE ALAILHCVAT | 300 |
| PLLLALFCHQ | ATRTLLPSLP | LPEGWSSHLD | TLGSKS | 336 |
Рис. 10.2. Аминокислотная последовательность Fy-гликопротеина.
Chaudhury и соавт. [28], изучив последовательность аминокислот в очи-щенных Duffy-гликопротеинах, сконструировали олигонуклеотидные прай-меры и с помощью ПЦР изменили кодирующий участок ДНК, полученной от лиц Fy(a −b + ). Затем этот продукт был использован для выделения кодирующей ДНК из библиотеки ДНК костномозговых клеток человека. В результате иссле-дования получен пептид из 338 аминокислот с мол. массой 35,7 кДа (рис. 10.3).
Neote и соавт. [123] установили, что Fy-гликопротеин структуриро-ван в виде α-спиралей, 7 раз пересекающих мембрану эритроцитов, имеет
612
Рис. 10.3. Генетическая карта локуса Fy.
экстрацеллюлярный N- и цитоплазматический С-домены (см. рис. 10.1). Такое строение свойственно хемокиновым рецепторам (Ji и соавт. [81], Murdoch, Finn [120]). Экстрацеллюлярный домен, состоящий из 65 аминокислот, име-ет 3 участка N -гликозилирования – позиции 16, 27 и 33. Антитела анти-Fy6 реагировали с синтетическим пептидом, представляющим собой фрагмент N-терминального домена Fy-гликопротеина.
Первая из полученных образцов Duffy кДНК была представлена одним эк-зоном (Chaudhuri и соавт. [29], Iwamoto и соавт. [79], Tournamille и соавт. [160]).
Позднее Iwamoto и соавт. [77] показали, что в неэритроидных тканях пре-обладают транскрипты, состоящие из двух экзонов, разделенных 479 пара-ми кодонов. Первый экзон кодирует семь N-терминальных аминокислот Fy-гликопротеина, включая инициирующий трансляцию метиониновый кодон. Терминальный участок молекул Fy-гликопротеина представлен последователь-ностью MGNCLHRAEL (Iwamoto и соавт. [77]).
\endash \e регионе 5' гена FY нет TATA- и CAAT-боксов, однако имеется несколько участков SP1 и GATA, препятствующих транскрипции (Iwamoto и соавт. [79], Tournamille и соавт. [160]).
Генотипирование
Установление нуклеотидных замен, обусловливающих специфичность Fy a, Fy b и Fy, позволило проводить генотипирование плодов беременных, сенси-билизированных к антигену Fy a, с целью оценки риска ГБН (Goodrick и соавт. [55]). Нуклеотидная замена G 159 A, определяющая различия Fy a / Fy b, создает сайт рестрикции BanI в аллеле Fy a , а замена T 67 C – сайт StyI, определяющий различия Fy / Fy ab аллеля Fy (Iwamoto и соавт. [78], Tournamille и соавт. [160]). Генотип устанавливают с помощью ПЦР с использованием аллельспецифиче-ских праймеров С 67 (Fy), Т 67 (Fy a или Fy b), G 159 (Fy a), А 159 (Fy b или Fy)
613
(рис. 10.4) (Hessner и соавт. [69], Mullighan и соавт. [119], Olsson и соавт. [127]). Использование комбинаций пар праймеров позволяет усилить продукты реак-ции и проследить последовательности кодонов (см. табл. 10.4).
Рис. 10.4. Принцип Duffy-генотипирования с
использованием ПЦР и аллельспецифических праймеров C ← Fy a, A → Fy ab и G ← Fy a, A ← Fy b.
Больные серповидно-клеточной анемией, систематически получающие гемо-трансфузии, часто образуют антитела к различным аллоантигенам эритроцитов,
\endash \e том числе антигенам Duffy. Генотипирование доноров и реципиентов облег-чает процесс подбора совместимых пар по указанной системе. Люди Fy(a +b −) отличаются по способности вырабатывать клинически значимые анти-Fy b-антитела, которые могут вырабатываться только у лиц с генотипом Fy a / Fy a, но не Fy a / Fy, поскольку аллель Fy кодирует синтез Fy b-гликопротеина в неэри-троидных клетках. Таким образом, иммунная система лиц Fy a / Fy не восприни-мает антиген Fy b как чужеродный.
Дата: 2019-02-24, просмотров: 225.
